金春女 李云峰
延边州食品药品监督管理局药物科，吉林延吉 133000
[摘要] 目的 研究西红花的真伪鉴别以及西红花苷I、II的含量测定。方法 采用传统的鉴定方法针对西红花进行性状、显微以及TLC等鉴定。鉴定过程中需结合GC气相色谱法区分西红花的真伪，西红花中其主要的成分测定则采用反相高效液相色谱方法。结果 从性状的研究结果来看，其在性状上产生的差异较大，显微镜观察其差异也很大，利用气相色谱和西红花苷含量测定显示西红花苷II的保留时间大约为8.83 min，而西红花苷I保留时间为5.71 min。结论 采用传统的方法进行西红花以及类似品种进行区分。采用气相色谱方法可以有效的区分西红花和其他的混伪品种，同时来针对西红花苷I和西红花苷II等进行含量测定，其方法较之传统的方法更加简洁，标准。
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关键词 ] 西红花；真伪鉴别；西红花苷I；西红花苷II；含量
[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）10（a）-0188-02
[作者简介] 金春女（1973-），女，朝鲜族，吉林省延吉市，大学本科，主管药师，中药材方向。
西红花苷类是西红花的主要成分，其性质极其不稳定，正由于这个原因，在含量的检测时往往受到比较大的影响，从而影响检测结果。目前针对西红花的苷类成分检测的方法主要有薄层扫描法、分光光度法。在2010年版的中国药典中提到了一种高效液相色谱法，并利用该方法检测西红花中的苷-Ⅰ和苷-Ⅱ类的含量，并指出两种化合物的含量的总量不得低于10.0%，随后有的学者提出采用药典的方法测定西红花样品时操作的步骤比较麻烦，并且测定的峰形较差、出峰也较晚、柱效低，而利用水和乙腈对梯度进行洗脱，其分离度和峰形都较好，并且理论塔板数超过了20000[1]。根据这个研究成果，本文就2013年1月—2014年1月间利用了高效液相色谱梯度洗脱的方式来检测我国不同地区生产的西红花中的苷-Ⅰ和苷-Ⅱ类的含量，以下为相关人士提供一点理论数据。
1 气相色谱法鉴定西红花
1.1 试验器材
仪器选取：上海天普分析仪器有限公司；仪器型号为GC9008B高性能气相色谱仪；检测器：氢火焰离子检测器，灵敏度为：Mt≤1×10-11g/s；温度控制为35~39℃，控温路数为3路。
试剂选取：选择天津市化学试剂有限公司生产的石油醚（60~90℃）。
1.2 溶液制备
首先将西红花干燥柱头置于硅胶干燥器之中，在常温减压情况下干燥24 h，将其粉碎之后过100目筛子，并精确称取0.5g，置于50 mL具塞锥形瓶之中，并且加入20 mL的石油醚，对其进行超声处理，处理60 min之后，取出、溶解、过滤。将过滤物置于风厨中自然常温挥干，然后用石油醚定容至2 mL，过微孔滤膜获得西红花溶液[2]。
1.3 色谱检测条件
色谱柱为HP-5毛细管色谱柱，柱温度为70℃，保持该温度2 min，然后以10℃/min升为120℃，持续5 min之后，再以15℃/min上升至23℃，再保持20 min。另选取的载气为N2，纯度为99.99%，检测器为FID，其检测的温度为25℃，流速为1.4 mL/min，分流比例为5:1，进样量为2μL。
1.4 结果
结果显示，对样品进行气相色谱法分析，排除溶剂峰影响之后，对上述的样品色谱进行分类，其正品、掺伪品和伪品。气相色谱结果显示，西红花大多含有多种挥发性成分，因此在色谱图中多以A、B、C等色谱峰为其特征峰。在伪品的色谱图中15~30min多种化学成分堆积在一起，且色谱图显示特征明显。掺假品的色谱图中，可以在A、B、C区域分别出真品特征峰，且在15~30min可清晰看到伪品的特征峰，此可充分证实样品为混合品。
2 西红花样品提取试验
实验的主要仪器有美国Agilent 1100高效液相色谱仪、柱温箱、自动进样器、ChenmStations 色谱工作站、低压四元梯度泵、二极管阵列检测器、HS6150超声清洗仪、AUW220D电子天平、Milli-Q超纯水系统。实验的主要试剂有sigmal公司的乙腈、大于97%的西红花苷Ⅰ和大于98%的西红花苷Ⅱ，来源于上海研晶生物科技有限公司。
2.1 供试品溶液的制作
取出经过三号筛的样品粉末0.1 g，称定后放入到事先准备好的干燥的锥形瓶中，然后加入含50%甲醇水溶液20 mL，再将溶液进行30 min的超声处理，处理后将其放冷，再过滤，滤渣用50%的甲醇水溶液反复洗涤几次，然后将其合并到50 mL的容量瓶中，再将含样品成分的50%的甲醇水溶液定容至标准刻度处并充分摇匀，最后将该定容的溶液用0.45 um微孔滤膜过滤，供试品溶液制作完成[3]。
2.2 对照品的溶液制作
分别精准称量取出西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ，用50%甲醇水制成2mg/mL的对照品储备液，然后将其放入到4℃的冰箱中保存。混合的对照品溶液是由原储备的西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ混合后加入50%甲醇水溶液稀释制作而成的，溶液中的西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的浓度都为1mg/mL。
2.3 检测条件
色谱柱使用Agilent ZORBAX StableBond SB-Aq型号色谱柱，其流动相使用0.01%的甲醇水和乙腈，其梯度洗脱为0~8min（75%~70%甲酸水），8~10min（70%~60%的甲醇水），10~25min（60%~30%的甲醇水）；其流速控制在1mL/min，柱温度控制在30℃，检测其波长为440nm，进样量为5uL，在此色谱条件下，两峰理论塔板数>4000，其分离度>1.5[4]。
3 西红花性状鉴别
3.1 正品西红花的性状
正品西红花为线形，暗红色，偶尔会存在着三分枝，顶端边缘具有不规则的齿状，上部略微扁平并且较宽，下端有时会残留一截黄色的花柱，其内侧具有一条较短的裂缝，整个西红花的长度大概为1~2 cm。西红花没有油滑的光泽，身轻，质地也较为松软，干燥的西红花很脆，很容易断裂为碎片，西红花的味道略微苦涩，气味也较为特异[5]。
3.2 混伪西红花的性状
红花就是常见的混为西红花中的一种，红花是一种菊科植物，其为一种没有子房的管状花，整体的平均长度大概为1.5 cm。红花的花冠颜色多为红色或者黄色，花冠的筒部细而长，其上部呈现5裂状，裂片呈现狭线形，长度大概在5~7 mm之间。红花的柱头稍微露出花药筒，为圆柱形，顶端有分叉。红花整体质地较为柔软，味道略微苦涩，气味略带香气[6]。
3.3 西红花显微特征观察
正品西红花的表皮细胞呈长方形，有一点弯曲，壁较薄，一部分的表面外壁呈绒毛状，有的呈乳头状，纹理纤细而清晰。西红花的柱头顶端表皮细胞呈绒毛状，纹理较为稀疏。草酸钙结晶主要集中在薄壁细胞中，在光下为亮白色，其形状多种多样，如长方形、颗粒性、梭形、圆簇形。西红花的花粉粒形状为圆球形，直径大约在70~160 um之间，外壁两层厚度一样，其表面具有一些细小的刺状雕纹。
4 讨论
4.1 西红花性状鉴别
伪西红花从性状上来看，其颜色绝大部分都要比正品的西红花颜色更为鲜艳，这是因为生产时使用了一些染色颜料导致的，对于这类情况，通常可以用手对其进行搓揉，如果发现手上有红色的染料，则可以说明该西红花是经过了染色的。根据以往的实验来看，市场上的很多伪西红花通常是用纸浆制作的，也有用油性物质和莲须等加工制作的，经过这类手段制作的伪西红花通常有一股油性的味道，同时市场上还存在着玉蜀黍柱头冒充西红花的情况，此外将提取的劣品掺入到正品西红花中和将其他物质掺入到正品西红花中的情况也比较多，这类情况通常很难用肉眼鉴别出真伪。
对西红花的显微鉴别是在西红花粉末状态下进行的，上述也提到西红花的显微鉴别具体特征有花粉粒呈圆球形、表皮细胞长方形、壁薄、微弯曲、表面有稀疏的齿状雕纹等等，这些西红花的显微特征很明显可以和玉米须、化学纸浆、莲须等伪劣品进行区分，对西红花中掺入红花也可以进行有效的区分，红花的花粉粒是圆形，并且有三个典型的萌发孔[7]。
4.2西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的含量检测
4.2.1 洗脱条件和流动相的选择对于西红花苷的含量检测，以前有的学者对不同流动系统和洗脱的条件进行了对比，发现以0.01%甲醇水和乙腈的效果比较好，再借鉴了药典中提到的洗脱条件，从而选择了梯度洗脱方式，选择梯度洗脱的方式可以让西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ两种化合物的峰形较好，出峰的时间也较早并且分离度也较高。
4.2.2检测波长的选择采用全波长扫描的方式对样品进行扫描，从中发现西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ两种化合物的最大吸收波长，然后对两种化合物进行综合考虑，选择出440nm为检测的波长，该波长能够满足西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ两种化合物的吸收值都较大。
4.2.3 提取方案的选择实验中，对西红花药材的提取方法、提取溶剂、提取时间、提取次数等进行重点考虑，以西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ两种化合物的提取率为标准指标，通过以前的实验结果得知，采用50%的甲醇水溶液再经超声提取效果最佳，提取时间在30 min。样品处理的办法和药典水浴超声的方法相比，前者的操作更为简单，也更容易控制，该方法主要注意一个问题，即防止因为超声温度而影响样品提取率。
4.3 讨论结果分析
经过本次试验，针对西红花进行传统、TLC和显微方法进行鉴别分析，其仅仅是对西红花和混伪品进行了一个初步分析。另外根据色谱图研究显示，西红花其正品和伪品之间的图像呈现明显差异，这与李伟等人在气相色谱法用于西红花的真伪鉴别研究中给出的结果一致[7]。本次针对西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的含量检测进行研究，无论是从洗脱条件以及流动相的选择上均是经过精心准备，同样根据既定的提取方案以及检测波长的确定来选取较为切合检查结果的方式，得出了不同西红花苷I和西红花苷II的差异性。
5 结语
本研究结果基本取得预期结果，从性状、显微、TLC以及现代的气相色谱分析能很好的鉴别西红花及其混伪品；国产西红花中主要成分西红花苷I和西红花苷II的含量测定结果也显示一定的规律，为有效的控制西红花的质量提供了一定的参考依据。在研究的过程中，我们发现如果实验样品处理的不好，西红花主成分很容易转化成其他的物质，导致西红花主成分的含量明显减低，但转化的原因尚不清楚，有待进一步研究。
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参考文献]
[1]李顺旭.西红花的真伪鉴别及主要成分西红花苷Ⅰ、Ⅱ的含量测定[D].湖南中医药大学，2011.
[2]付小梅，彭水梅，刘婧，等.HPLC法同时测定栀子类药材中10个主要有效成分的含量[J].药物分析杂志，2014（4）:615-621.
[3]石凤鸣，王文君，陈雏，等.栀子指纹图谱及不同生长期西红花苷和栀子苷含量的研究[J].时珍国医国药，2011（8）:1874-1876.
[4]曹佳佳.两种药物有效成分与有关物质的提取分离及含量测定研究[D].浙江工业大学，2013.
[5]王子雯.不同采收期巴中产栀子有效成分含量测定与指纹图谱研究[D].泸州医学院，2013.
[6]陈阳，赵璨，张浩，等.栀子黄OD值、色价与西红花苷和栀子苷的相关性研究[J].食品科技，2010（5）:262-265，270.
[7]李顺旭，杨大坚，李伟，等.气相色谱法用于西红花的真伪鉴别研究[J].中南药学，2010（10）:729-732.
（收稿日期：2014-07-28）
