佟玉风 巴根那*白梅荣 包明兰 叶日贵拉喜 那木吉拉
内蒙古民族大学，内蒙古通辽028000
【摘要】目的：研究肋柱花水煎液在D-GlaN致急性肝损伤模型大鼠尿液中的化学成分。方法：采用腹腔注射D-GlaN制备急性肝损伤大鼠模型；利用液质联用法对模型大鼠灌胃肋柱花水煎液后尿液中化学成分进行分析，检测波长280nm；流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液；流速1.0ml/min；柱温35℃；梯度洗脱，质谱定性采用多级离子阱质谱，负离子模式扫描。结果：在含药尿液中共标识19个峰，1个为药物原型成分，14个为代谢产物，其余为尿液内源性成分。结论：该方法较全面的分析肋柱花在急性肝损伤模型大鼠尿液中的化学成分，为进一步研究肋柱花药效物质基础提供依据。
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关键词 肋柱花；液质联用；急性肝损伤模型；尿液
【中图分类号】R284.1【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2015)05-0012-03
肋柱花为龙胆科肋柱花属植物肋柱花Lomatogonium rotatum(L.)Fries ex Nym的干燥全草。广布在我国西藏、云南、四川、青海、甘肃、新疆、内蒙、山西和河北。该药是蒙医特色药材，具有平息协日、清热、健胃、愈伤之功。主要用于清协日热、瘟疫、流感、伤寒、中暑头痛、肝胆热、黄疸、胃协日、伤热等病症［1］。1998年收载于卫生部药品标准（蒙药分册）。近年来，研究资料显示，肋柱花所含黄酮类化合物、木犀草素、齐敦果酸等均具有不同程度的利胆、保肝活性［2］，在一定程度上提示肋柱花可用于治疗肝胆疾病。
课题组对该药材乙酸乙酯、氯仿、正丁醇及石油醚提取物化学成分进行系统研究，并发现了新化学成分［3-6］ 。本研究通过灌胃给予D-GlaN致急性肝损伤模型大鼠肋柱花水煎液，收集24h的尿液样品，通过液质联用技术，对色谱峰归属进行分析，为进一步研究肋柱花药效物质基础提供了方法学基础。
1仪器与材料
1.1仪器Agilent 1100 series LC-MSD 液质联用仪（包括：Agilent SL 型多级离子阱质谱仪、低压四元梯度泵、DAD二级管阵列检测器、自动进样、柱温箱、chemistation化学工作站）；Agilent 1260 Infinitely半制备高效液相色谱仪（美国安捷伦）；TGL-20B高速离心机；KQ-200VDE双频数控超声波清洗器；AUW120D电子分析天平；DP-01无油真空泵；过滤器和普通玻璃仪器等。
1.2药物和试剂肋柱花药材（兴安盟左翼中旗）；木犀草素（批号：111520-200504）、齐墩果酸（批号：110709-201206）、獐牙菜苦苷（批号：0785-200203）购自中国药品生物制品检定所；甲醇、甲酸为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。
1.3动物SPF级Wistar雄性大鼠，体重(200±10)g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。
2方法与结果
2.1肋柱花水提物制备称取1kg肋柱花，第一次加水量为10倍，煎煮提取1.5h，第二次加水量为8倍，煎煮提取1h，第三次加水量为6倍，煎煮提取1h，共提取3次，合并3次提取液减压浓缩，干燥得浸膏，低温保存待用。
2.2体外药材溶液的制备精密称取肋柱花浸膏0.1177g，置于100ml锥形瓶中，精密加入25ml色谱甲醇，密塞，称定重量70.6425g（具塞），超声40min后放冷，再称定重量，用色谱甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密吸取上液1ml过0.45μm微孔滤膜，得待测溶液。
2.3对照品溶液的制备精密称取獐牙菜苦苷1.1mg、木犀草素1.2mg、齐墩果酸1mg，分别置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，取1ml上清液，过0.45μm微孔滤膜，得标准品溶液。
2.4色谱条件色谱柱：Venusil MP C18(4.6×300mm，5μm)；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为甲醇；柱温：35℃；进样体积：30μl；流速：1.0ml/min；检测波长：280nm，梯度洗脱。如表1。
2.5质谱条件电离源：电喷雾离子源（ESI）；检测方式：负离子检测；扫描范围：m/z 50~800；干燥气温度：350℃；干燥气流量9.0L/min；雾化气压强：0.24MPa（35.0psi）；毛细管电压：4000V。实验数据采用Data Analysis软件处理。
2.6D-GlaN致急性肝损伤模型的复制［7］选取大鼠16只，按体重随机分为正常对照组和模型组，模型腹腔注射300mg/kg D-GlaN 24h后处死小鼠，观察血清AST、ALT含量，正常对照组腹腔注射300mg/kg生理盐水，判断模型是否成功。
2.7尿液样品的收集取Wistar雄性大鼠15只，随机分为空白组，模型组，模型加肋柱花组，每组各5只。将大鼠正常饲养3d使其适应环境，从第4天开始模型加肋柱花组按5.4g/kg剂量灌胃肋柱花水煎液，空白组和模型组灌胃等容量的生理盐水，每天1次，连续7d，于末次给药后1h，模型组和模型加肋柱花组大鼠按照300mg/kg腹腔注射D-GlaN进行造模。将各组大鼠置于代谢笼中，分别收集24h尿液，将尿液置于-40℃冰箱备用。
2.8尿液样品的预处理［8］
2.8.1乙酸乙酯萃取法将冻存的各组尿液样品置于室温下缓慢融化， 12000r/min离心10min，取上清液2.0ml，每次加2倍量乙酸乙酯，萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至干，用1.0ml色谱甲醇超声溶解，0.22μm微孔滤膜过滤备用。
2.8.2SPE小柱固相萃取法将冻存的各组尿液置于室温下缓慢溶解， 12000r/min离心10min，取上清液2ml，用HBL固相萃取柱进行纯化，先用1ml蒸馏水洗去杂质，洗脱液弃用；再用2ml甲醇洗脱，减压浓缩至干，残渣用1ml色谱甲醇溶解，0.22μm微孔滤膜过滤备用。
2.8.3正丁醇萃取法将冻存的空白及给药组尿液样品置于室温下缓慢融化，12000r/min离心10min，取上清液2.0ml，每次加2倍水饱和的正丁醇溶液，萃取3次，合并萃取液，减压浓缩至干，用1.0ml色谱甲醇超声溶解，0.22μm 微孔滤膜过滤备用。
2.9液质联用图谱测定分别吸取空白尿液、模型尿液、含药尿液供试品溶液、体外药材溶液及对照品溶液各30μl进样，记录60min的色谱图。
2.10结果对比空白尿液、模型尿液、肋柱花尿液、肋柱花体外药材HPLC图谱，发现肋柱花尿液共标识19个成分，结合保留时间、紫外吸收和二级质谱分析得知4、8、13、19号峰为尿液内源性成分，15号峰为药物原型成分，1、2、3、5、6、7、9、10、11、12、14、16、17、18号峰推测其为体内代谢产物。LC图谱比较如下图：
3讨论
3.1尿液样品处理方法的选择通过对比SPE小柱固相萃取法、乙酸乙酯萃取法和正丁醇萃取法液相图谱，发现SPE小柱固相萃取法的选择性好、保留成分多、引入杂质量少，对样品起到了很好的纯化作用，可作为含药尿液的处理方法。
3.2流动相和检测波长的选择 实验中分别尝试了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液等不同流动相梯度洗脱，对比发现甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相的峰型好，分离度良好，故选择了甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱为流动相。检测波长分别测定了210、238、254、280、305nm，其中在280nm波长下基线平稳，分离度良好，故选择了280nm为检测波长。
3.3结论课题组前期实验研究表明肋柱花具有一定的保肝作用［9］，经过适当途径给药后，在体内经过吸收、代谢等过程最后吸收入血的往往是多个单体成分形成的有效成分群，其结构既可以是肋柱花的原型成分，也可以是代谢产物或肋柱花中各成分间相互反应形成的新成分，还可以是机体在药物作用下生成的新的内源性生理活性物质。这些物质均须以血液为介质输送到靶点才能产生作用，药物入血后通过肾脏的代谢排泄，由血液进入原尿中，外源性成分（肋柱花原型成分及其代谢产物）在尿液中的含量一般情况下都要高于在血浆中的含量，所以，通过分析尿液中的化学成分，阐明体内直接作用物质，将成为快速、准确的研究肋柱花药效物质基础的有效方式。本实验采用液相色谱/离子阱质谱(LC / MSD Trap)联用技术，结合保留时间、紫外吸收和二级质谱分析，对肋柱花尿液中化学成分进行了定性分析，共标识19个峰，1个成分为药物原型，14个成分为代谢产物，其余为尿液内源性成分。若要明确其肋柱花尿液化学成分结构，需通过制备技术以及核磁共振等其他分析方法来进一步研究，以得到明确的结构。
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参考文献
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(收稿日期：2014.12.07)
