现如今国家对医学病毒学的研究都是非常重视的，最近几年也是有很多人都因为一些病毒感染而受到一定的威胁，所以对医学病毒学的研究也是势在必行，本文就整理了关于医学病毒学的论文来供大家欣赏。
第1篇：乙肝患者病毒学检验的临床分析
臧旭
【摘要】目的研究对乙型肝炎(乙肝)患者进行病毒学检验的作用。方法320例进行乙肝病毒检查的疑似患者，对所有患者的血液样本进行乙肝病毒两对半检验，通过检验结果断定患者是否为乙肝感染以及是否存在传染性，并将检验结果与乙肝病毒的脱氧核糖核酸(HBV-DNA)的检验结果进行比较分析。结果检验结果显示，共计198例样本显示存在乙肝感染的情况，其余122例样本显示未受到病毒感染，198例感染样本中，大三阳80例、小三阳118例。所有乙肝患者均存在乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性的情况，HBV-DNA检测中＜50U/ml的共计201例，乙肝病毒两对半检验结果与HBV-DNA检测结果比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论对乙肝患者进行病毒两对半检验具有较为显著的临床效果，既能够诊断出患者是否存在乙肝病毒感染的情况，又能对乙肝病毒携带者现阶段是否具有病毒传染性进行判定，值得临床推广使用。
【关键词】乙型肝炎；病毒学检验；临床分析
乙型肝炎病毒性感染是指因乙型肝炎病毒引起的主要以肝脏病变为临床表现的传染病，患者患病后主要症状有恶心、呕吐、食欲不振、上腹部压痛、肝部疼痛、浑身乏力等，少部分患者可能存在发热、黄疸以及肝功能受损的情况［1］。如患者患病后未能及时接受有效的治疗，不仅会传染给他人，甚至威胁到生命，不仅对自身健康及生存有影响，还会影响到他人身体健康，甚而威胁到他人生存［2］。该病具有潜伏期长、临床症状多样性等特点，本文为提高乙肝的确诊率，对乙肝患者病毒学检验的临床作用进行了分析。现报告如下。
1资料与方法
1.1一般资料选取2016年5月～2017年5月在某院进行乙肝病毒检查的疑似患者320例作为研究对象，其中男223例，女97例；年龄19～65岁，平均年龄(39.0±8.6)岁；存在食欲不佳、上腹部疼痛的患者82例，存在肝部疼痛的患者33例，存在身体乏力、精神不佳的患者67例，存在蜘蛛痣的患者5例，其余患者不存在较为明显的不适感，进行例行乙肝检查。排除存在乙肝病史、患有原发性肝脏疾病的患者。
1.2方法对所有患者进行乙肝病毒两对半以及HBVDNA检查，并对两种检查结果进行分析、对比。如患者存在乙肝病毒感染的情况，还需对其传染情况、肝功能情况进行检查，对肝功能受损程度进行评估。如患者存在广泛肝细胞坏死的情况，则需对其进行甲胎蛋白(AFP)检查［3］。
1.3判定标准
1.3.1患者不存在乙型肝炎病毒感染(乙型肝炎病毒学两对半检测正常值范围)：①HBsAg≤0.5ng/ml；②乙型肝炎表面抗体(HBsAb)≤10mIU/ml；③乙型肝炎E抗原(HBeAg)≤0.5PEIU/ml；④乙型肝炎E抗体(HBeAb)定量≤0.2PEIU/ml；⑤乙型肝炎核心抗体(HBcAb)≤0.9PEIU/ml。
1.3.2患者存在乙型肝炎病毒感染：①HBsAg阳性；②HBeAg阳性；③乙型肝炎核心抗体1gM(抗-HBc1gM)阳性，则高滴度(≤1∶1000)；④HBV-DNA呈阳性，则可断定为乙肝感染。
1.4统计学方法采用spss19.0统计学软件处理数据。计数资料以率(%)表示，采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2结果
320例血样检查中，判定符合乙肝感染情况的血样为198例，未感染病毒的122例；被诊断为大三阳的患者80例、小三阳的患者118例；HBV-DNA检测呈阳性的共计201例。通过对已感染乙肝的血样和正常血样对比可以发现，所有被判断存在乙肝感染的血样HBsAg均呈阳性，正常血样中HBsAg阳性的仅有31例，但HBsAg阳性血样中有65例DNA检测正常。在198例感染样本中HBeAg患者80例、HBeAb患者118例，在所有血样中HBcAb阳性例数为241例，其中正常人群中存在43例。通过普通酶联方法检测显示，HBV-DNA＜50U/ml的患者共计201例，检验结果与乙肝病毒两对检验结果比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
3讨论
乙型肝炎在我国具有较高的发病率，根据临床相关资料显示我国人均乙肝病毒携带率高达7.18%，与其他国家相比，我国乙肝发病率相对较高［4］。该病是因乙型病毒性感染，以肝脏病变为表现的一种传染性疾病，患者患病后通常会出现恶心、乏力、四肢无力、上腹部压痛、肝部不适等症状，患者患病后如未能及时接受治疗，其肝功能会受到一定的损害，乙肝是引起其他肝脏类疾病的一个危险因素，并且会传染给他人，造成病毒流行［5］。乙肝具有一定的潜伏期，并且其临床表现较为多样性，给确诊带来了较大的难度，因而如何准确对是否存在乙肝病毒感染进行判定是临床一直研究的课题。有研究为提高乙肝的诊断准确率，对乙肝患者病毒学检测方法进行分析，已经取得很好的成果，现将研究数据整理后进行归纳总结，研究成果总结分析如下。
乙肝病毒学两对半检查以及乙肝DNA检测是乙肝病毒学指标的重要组成部分，是判断机体是否存在乙型肝炎病毒感染最直观的方式。除了确诊是否存在乙型肝炎病毒感染外，还能够通过它对机体肝脏受损程度以及其传染性进行分析［6］。乙肝病毒两对半检测是临床应用率最高的一种乙型肝炎病毒感染检测方式，具有成本低、操作简便、准确率高的等特点，比较适用于基层医院。在本文的研究中，判断患者是否存在乙型肝炎病毒感染的主要标准即为HBsAg是否为阳性，如为阳性则说明患者机体已经携带乙肝病毒。如患者曾经感染过乙肝病毒，则机体内会存在乙肝核心抗体，单独核心抗体阳性仅能证明感染过乙肝，需与HBeAg以及HBsAg一起分析才具有临床意义。HBeAg属于乙肝病毒的核心，因而通常临床将HBeAg作为存在传染性的判断依据。如若HBeAg呈阳性，HBsAg与HBcAb均呈阳性，则为大三阳，大三阳说明机体病毒较为活跃，复制性较高，具有较大的传染性［7-10］。
在本文的研究中大三阳患者HBeAg呈阳性，并且HBsAg和HBcAb为阳性，并且HBV-DNA也为阳性；小三阳患者HBeAg、HBsAg以及HBcAb均呈阳性，但HBV-DNA呈阴性，因而可以说明HBV-DNA是乙肝病毒是否具有传染性的最直观、最准确的指标，当HBV-DNA呈阳性，则说明乙肝病毒感染存在较强的传染性，HBV-DNA越高则表明病毒的复制能力越高，传染性越强，危害性越大。疑似患者通过乙型肝炎病毒两对半初筛检测确诊乙型肝炎病毒感染后，进一步做HBV-DNA检测，就可以使临床医生能够对乙型肝炎患者的传染性进行定量评估。
综上所述，疑似乙型肝炎病毒感染患者经过乙肝病毒学两对半检验能够进行有效初筛，对患者进一步做HBV-DNA病毒学检验，不仅能够更为准确的确诊患者是否为乙型肝炎病毒携带者，还能够对乙肝病毒的传染性以及对肝脏的损伤程度进行准确的判断。两相结合，对于广大群众预防以及临床治疗乙型病毒性肝炎具有重要作用，临床应用价值较高，值得继续推广使用。
第2篇：高通量测序技术在临床病毒学领域的应用
张拥军
摘要：本文总结了近几年高通量测序平台的发展现状，比较了不同测序平台的性能及特点。同时还对目前高通量测序平台在近两年临床病毒学领域的应用，包括病原学诊断、分子流行病学、宏基因组学和临床治疗转归等几个方面，逐一举例进行了阐述。籍此加深专业人员对高通量测序平台的认识，促进该技术在临床病毒学的转化与应用。
关键词：高通量测序；宏基因组学；病毒学
2004年454生命科学公司率先推出商品化的GS-20测序仪，宣告了高通量测序(NGS)时代的到来。经过近10年的不断更新，从技术层面看，各种NGS平台日新月异，仪器试剂逐渐成熟，测序速度、读长及通量得到了大幅度提升，相对测序成本则急剧下降。在应用方面，NGS技术愈来愈多地运用于全基因组测序、宏基因组学(metagenomics)、转录组(transcriptome)测序、目标序列再测序(resequencing)、从头测序(denovosequencing)、染色体免疫共沉淀测序(ChIP-Seq)、外显子组测序(exomesequencing)以及各种RNA测序等方面，已经渗透到生命科学多种领域如临床医学、农业、生态学、法医、微生物学、癌症研究等。本文拟简要介绍目前NGS平台的发展现状，并对近两年NGS平台在临床病毒学方面的部分应用进行概述。
1NGS平台现状简介
近10年里各种NGS平台不断推陈出新，按时间先后顺序，主要出现了以下主流NGS平台。首先，454生命科学公司于2004年开始销售基于焦磷酸测序的GS-20测序仪，首次实现了大规模并行测序，能够同时测定约20万个片段，平均读长为110bp。在被罗氏公司并购之后，454公司又将GS-FLX、GS-Junior等机型推向市场，平均读长达到700～1000bp；2005年Solexa公司研制了基因组分析仪(GenomeAnalyzer)，被Illumina公司收购后，又在此基础上陆续发展出HiSeq2000、HiSeq2500、NextSeq500、MiSeq、HiSeqXTen等系列测序仪，满足了不同层次测序的需求，最大读长已经能够达到600bp；2007年应用生物系统公司(ABI)推出第一款SOLiD测序系统；而生命技术公司(LifeTechnologies)收购ABI之后，不仅接连推出了SOLiD3、SOLiD4、SOLiD5500等机型，还分别于2009年和2011年推出了商品化的Helicos测序仪和IonTorrent个人基因组测序仪，近年又研制了通量更高的IonProton、IonChef测序仪；作为第三代单分子测序仪的代表，太平洋生物科学公司(PacificBiosciences)于2011年推出了单分子实时测序仪PacBio-RS，测序读长达到数千个碱基；英国的OxfordNanoporeTechnologies公司则研制成功读长更长的GridION、MinION测序仪[1-3]。
不同于传统的以毛细管电泳为基础的第一代测序技术，NGS平台基本上采用边合成边测序(sequencing-by-synthesis，SBS)的策略，也无需预先知道测序模板的遗传背景，就能够同时完成数十万到数亿个片段的测序，成为真正意义上的高通量。从测序原理上，454、IonTorrent和SOLiD体系都采用乳液PCR制备样品文库，每一个珠子结合一段DNA模板，并均匀分配到测序孔或者玻片，实现一个珠子对应一个测序片段(read)。Illumina/Solexa技术则是先将测序文库DNA变性，一端与固定在玻片上的寡核苷酸接头结合，每个片段的另一端与玻片上的互补接头结合，形成桥式结构，因此将这个在玻片进行的模板扩增称为桥式PCR。从测序反应来看，454体系采用焦磷酸测序，测序需要的酶和引物都在反应孔中，每次加入1种未标记的核苷酸，有碱基掺入时，释放出的焦磷酸盐产生发光，逐一被光学摄像头记录下来。IonTorrent平台与454体系类似，只是检测信号为碱基掺入时释放的H离子，不需要光学设备记录信号，因此也称半导体测序仪。该平台先后提供了314、316和318芯片供用户选择，平均读长为100～400bp。Illumina/Solexa体系的试剂包括引物、DNA聚合酶及4种不同标记的可逆终止核苷酸。每掺入一个核苷酸，根据不同荧光颜色记录下来。SOLiD体系采用的是连接反应来完成测序。通过测序引物与接头杂交，其5′端再与相邻序列上杂交的寡核苷酸连接，不同荧光标记的寡核苷酸混合物互相竞争与引物的连接，每次掺入2个碱基。PacBio-RS测序仪也是采取SBS策略，不同的是，其测序文库模板不需要扩增，实现了单分子实时测序。单链基因组DNA片段与带发卡结构的接头连接，形成环状分子，然后与固定在该仪器独有的纳米小孔——ZMW上的DNA聚合酶结合，通过记录掺入核苷酸上不同荧光基团达到测序的目的。PacBio-RS读长能够达到20kb以上，平均为5kb。同样，GridION和MinION体系也不涉及模板扩增过程，属于无标记的单分子测序。当单链DNA分子通过一种蛋白质纳米孔，链上每一个碱基产生的电信号依次被记录下来。这种测序方法读长可以达到数万个碱基，是目前读长最长的高通量测序方法[1-3]。
为了满足一些小实验室的需求，并将NGS平台运用于临床诊断市场，这些公司还生产了一些通量较小的台式NGS平台。例如，2009年罗氏公司推出的GSJunior测序仪，可以在10h内获得35Mb序列数据，平均读长400bp。2011年Illumina公司的MiSeq测序仪投放市场，27h可以得到1.5Gb数据，平均读长为150bp。目前升级后的试剂盒能够产生2千5百万个片段，每个片段可达2×300bp的读长，也就是一个反应能够得到共计15Gb的序列。而同年生命技术公司推出的台式NGS平台IonTorrent能够在2h内获得测序结果，至今仍然是测序时间最短的台式NGS仪器。这些平台由于单次运行成本低，数小时内可以获取序列结果，特别适合一些小基因组和PCR产物的测序，具有临床辅助诊断的潜力[1-3]。
2在临床病毒学领域的应用
病毒作为一种古老的物种，广泛存在于自然界，几乎能够在任何物种寄生，与人类健康息息相关。虽然大部分病毒感染没有出现明显的临床症状，少数病毒能够引起人类多种疾病，表现出包括发热、腹泻、出血、出疹、呼吸道症状、神经系统症状等，甚至一些病毒感染与肿瘤的发生有关。随着100多年来人们对病毒认识的不断深入以及生物技术的发展，人类逐渐积累了多种病毒性疾病的鉴别诊断能力，掌握了部分病毒的致病机制及流行规律，研制出一些病毒的特异性疫苗，并设计生产了各种抗病毒化学药物，极大地降低了病毒性疾病的危害性。在NGS技术日渐成熟的过程中，全球科学家也在不断尝试将此技术及时转化到病毒学研究中去，特别是在未知病原学诊断、已知病毒性疾病的分子流行病学、从基因组水平探讨一些病毒的致病机理以及一些疾病的治疗及预后方面，利用生物技术进步促进人类健康。
2.1发现未知新病原大多数病毒性疾病都有传染性，能够通过各种途径或媒介传播，因此无论是发达国家还是发展中国家，传染病依然是威胁人类健康的因素之一。近30年来涌现的各类新发再发传染病暴发事件中，相当一部分与新病毒特别是RNA病毒的出现相关。传统的鉴定未知新病毒的方法，包括病毒分离培养、血清学检测、免疫电镜等，都需要相当长的周期，而一些致病性病毒暂时还没有合适的体外培养体系。NGS技术不依赖病原体遗传背景和高通量的特点，具有得天独厚的优势，尤其是能够从未经纯培养的复杂样品中，捕捉任何疑似病原体的蛛丝马迹。因此近几年一些新出现传染病疫情的病因调查，时常出现NGS平台的身影[4]。
首先，近几年在以下一些重要新发病毒病的发现过程中，各种NGS平台发挥了巨大作用。
1)新的蜱传播Thogotovirus[5]2014年春，1名50多岁的美国堪萨斯州男性在户外工作时被蜱叮咬，数日后发病，有恶心、发烧、疲劳、腹泻等症状。患者血小板减少，白细胞减少，起初予以强力霉素治疗，11天后死于多器官衰竭。美国CDC研究人员采用分子和血清学方法检测10余种已知蜱相关病原体均为阴性。但用蚀斑减少中和试验测定前几年新发现的Heartland病毒抗体时发现一种全新的病毒，经电镜观察疑似为正粘病毒。随后用IONTORRENT高通量测序平台，检测到多个节段基因组序列，与Dhori病毒相似度达70%，由此建立特异的实时荧光RT-PCR检方法，并在患者血样中证实了相关片段的存在。因此认为发现了一个正粘病毒科Thogotovirus病毒属的新成员。
2)SFTS调查[6]严重发热伴血小板减少综合征(SFTS)是2010年首先在中国中部和东北几个省出现的一种新流行性疾病，曾经通过传统的毛细管测序方法证实其病原体为一种新的布尼亚病毒(SFTSV)，主要经蜱传播。2012年秋，日本出现一例SFTS病例，患者死于多器官衰竭。研究人员进行回顾性调查时，将患者样品进行病毒分离培养，培养上清采用MiSeq平台测序，发现了多个与SFTSV同源的DNA序列片段。NGS测序结果为证实日本同样存在SFTS病例提供了直接证据。
2)MERS冠状病毒疫情[7]荷兰研究人员2012年从1例60岁沙特急性肺炎转肾衰的死亡病例痰液中，分离到1株未知冠状病毒(HCoV-EMC)。通过454GS-FLX测序平台，得到病毒基因组约90%的序列。序列分析显示该毒株与蝙蝠冠状病毒HKU4和HKU5遗传关系接近，为一种全新的beta冠状病毒。该病毒临床表现与2003年SARS相似，后来被命名为中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒。2015年5月底MERS疫情在韩国暴发，中国出现了首例来自韩国的输入病例。中、韩两国研究人员分别用IONTORRENT平台和Illumina平台测定病毒基因组序列，用于追溯病毒来源，经初步分析该毒株与今年2-5月沙特流行毒株最接近[8]。至今(2015年6月12日)已经累计有1289例实验室确诊MERS病例通报给WHO，至少455例死亡[9]
3)H7N7禽流感[10]最近一个意大利团队报道了一起人感染高致病性禽流感H7N7病毒的事件。2013年8-9月间，意大利几个农场出现了高致病性H7N7禽流感疫情，在处理疫情过程中，先后有3名工作人员出现不同程度的结膜炎。调查人员采集患者样品，通过实时荧光PCR证实了H7N7病毒感染，并用IonTorrentPGM平台对一株病毒进行了全基因组测序。HA和NA基因种系发生分析显示，毒株与近3年欧洲野鸟及家禽中流行的低致病性H7毒株类似，而内部基因序列则与该地区鸡群流行的H7N7毒株高度相似，也表明此病毒由鸡直接传播到人。
除了以上新发病毒性传染病，同样，NGS平台对一些常见病毒性感染病例，也能够从背景复杂样品中，更准确地探索相关致病因子。
4)呼吸道感染调查[11]丹麦科学家为了调查儿童急性呼吸道病毒感染的病原体，采集了500份上/下呼吸道感染样品，对其中92份样品采用GS-FLX平台测序，获得4个完整病毒基因组，分别属于人副流感病毒4型(HPIV4)的4a和4b亚型。根据测序结果，他们设计实时荧光RT-PCR引物，对所有样品进行筛查，发现HPIV4阳性率为2.6%。而后他们还利用PacBioRS平台对代表样品进行了测序，结果证明该平台能够用于复杂临床样品的病毒序列测定。
5)病毒性脑炎调查[12]能够引起病毒性脑膜脑炎的病毒超过100种，包括HSV-1、流感病毒、肠道病毒以及一些虫媒病毒等。由于涉及的病原种类繁多，只有少数病例被真正明确了实验室诊断。美国犹他大学医学院尝试用NGS技术调查一些脑炎病例中病毒类型。他们选择了7例脑炎死亡病例的脑组织，提取RNA并用随机引物进行逆转录。在HiSeq2000测序仪上，每一例患者和正常对照样品均得到50～90M读长为50bp的片段。在排除人体组织片段以后，7例患者脑组织里发现有36个片段与病毒有关，分别涉及以下病毒科：疱疹病毒科(17)、副粘病毒科(10)、痘病毒科(6)、戊肝病毒科(2)和黄病毒科(1)。但序列拼接以后7例患者样品只有5例存在66～4019bp的片段。经过传统PCR扩增及毛细管测序，证实2例为麻疹病毒，3例为HSV-1，另外2例未检出致病病毒序列。上述结果证明深度测序能够用于脑炎患者的病原体调查。
2.2追踪已知病原的变异及多样性分子流行病学是采用各种分子生物学手段，在分子或基因水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程，并研究疾病的防治和促进健康的策略和措施的科学。NGS技术应用于病毒性疾病的分子流行病学研究，可以一次性完成一些基因组较大的病毒如疱疹病毒、冠状病毒等的全基因组序列测定，也可以同时进行数十个甚至上百个样本中靶基因的扩增子测序，还可以通过深度测序阐明病毒在疾病发展过程中如何进化变异以及是否出现准种等。要完成这些目标，依靠传统的毛细管电泳测序，几乎是不可能实现的，并且试剂和时间成本会高很多。
具有代表性的典型应用有：
1)2014年西非EBOV疫情[13]埃博拉病毒(EBOV)自1976年在非洲发现，主要以非洲东部的散发病例为主。始于2014年2月的疫情，是首次出现在非洲西海岸几个国家(塞拉利昂、几内亚、利比里亚、尼日利亚)，也是迄今为止最大规模的埃博拉疫情。截至2014年8月31日，已经报告3685病例，死亡1641例。哈佛大学、Broad研究所与塞拉利昂一家医院合作，从5月底至6月中旬确诊的78例EBOV感染病例中，采用高通量测序的手段，共获得了99个完整的病毒基因组序列。他们的测序过程主要在HiSeq2500和PacBio-RS平台完成。结果显示，这次西非疫情毒株与以往EBOV基因组存在341个碱基变异，而塞拉利昂患者存在263个宿主间单个核苷酸变异(iSNV)。根据与以往暴发相关的20个毒株基因组进行种系发生比较，表明2014年这些西非EBOV是近10年中从非洲中部传播过来。同时，这些毒株的遗传相似性提示，此次暴发起因是接触单一的EBOV天然宿主，随后引起人与人的传播蔓延。序列数据还显示，塞拉利昂差不多同时传入了两种遗传背景不同的EBOV，该发现与收集到的流行病学调查信息一致。
2)荷兰H7N7人禽流感疫情[14]2003年2-5月，荷兰发生高致病性禽流感H7N7病毒暴发，9周内波及255个养鸡场，导致近3千万只鸡被扑杀。另外有89人被感染，1名兽医死亡。调查人员起初用第一代测序技术观察到死亡病例毒株存在PB2-E627K和HA-K416R的突变。时隔几年之后NGS技术成熟之时，他们又利用Illumina公司的GAIIx和HiSeq2000平台，对原始样品进行了深度测序。从原来养鸡场几份鸡样品中并未发现上述突变，但意外在禽样品中发现流感病毒缺陷RNA片段，表明病毒在感染禽类过程中合成了缺损的干扰病毒。在几份人样品中，还发现PB2-E627K突变随感染过程检出频率增高，强烈支持人类适应标志PB2-E627K是个体感染过程中逐渐形成的，减少人类暴露于禽流感病毒的机会，对于降低病毒适应人类是非常重要的。
3)乙型流感病毒基因组[15]自1980年代以来，乙型流感病毒(IBV)同时存在两种抗原性和遗传背景不同谱系的毒株：B/Victoria/2/87-like和B/Yamagata/16/88-like。为了对大量乙型流感病毒进行基因组测序并建立序列数据库，美国J.CraigVenter研究所(JCVI)建立了一套通用的基因组扩增方法，以便测序、构建疫苗和反向遗传学研究。他们将扩增产物在IonTorrentPGM、HiSeq2000、MiSeq以及454(Roche)平台进行测序。经过1000多个IBV临床样品的测试，证明该方法灵敏、有效、不依赖序列，适用于NGS测序基因组诊断以及快速克隆反向遗传学质粒。
4)鼻咽癌中EBV基因组[16]虽然40年前就已经知道未分化鼻咽癌(NPC)与EB病毒感染有关，但迄今仅测定了10株EB病毒毒株全基因组序列。EBV基因组全长近200kb，若用第一代毛细管电泳测序，成本高、耗时长。为了探索NPC样品中EB病毒基因组变异及多样性，香港大学团队首先在Miseq测序仪上测试了3株参比EBV序列，而后在此基础上利用GAIIx平台完成了来自患者病理切片的8株EBV基因组序列。与参比毒株比较，共发现1736处变异(包括1601个碱基替换、64处碱基插入、71处碱基删除)，编码多种蛋白的基因出现歧义突变。以上结果说明，从全基因组水平能够发现NPC患者EBV基因组的序列多样性，通过比较正常样品和NPC样品中EBV的基因组变异，有助于评价某些位点变异与NPC致病机制的联系。
2.3宏基因组学(病毒组)宏基因组学是研究不同生态环境中所有微生物组成，遗传结构及群落功能的科学。近几年有关人类宏基因组研究先后涉及皮肤、口腔、血液、粪便等，病毒宏基因组(viralmetagenome)或者病毒组(virome)指的是人类、动物、植物或者特定环境样品中所有病毒的集合。人类病毒组包括引起人类急性/持续性或潜伏感染的病毒，以及诸如内源性逆转录病毒之类的整合在人类基因组上面的病毒，开展这类研究有助于揭示新病毒及其与已知未知疾病的联系[17-19]。NGS平台对于这类相对较小的基因组进行深度测序，也不需要对每一个种类一一进行分离培养，具有与其它方法不过比拟的优越性。
根据不同组织部位的宏基因组研究结果，健康人体组织存在的病毒很多属于噬菌体，主要与人体胃肠道的正常菌群有关。除了噬菌体，不同组织中占优势的病毒种类也不一致。人体皮肤主要检出过包括Merkel细胞多瘤病毒(一种与皮肤癌有关的DNA病毒)在内的一些多瘤病毒(HPyV6、7、9)，以及多种β-和γ-人乳头状瘤病毒(HPV)和圆环病毒科(Circoviridae)的一些成员；呼吸道常见EB病毒和逆转录病毒；口腔和鼻咽部可以检测到多种呼吸道病毒，如人呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒和鼻病毒，健康儿童呼吸道样品还发现腺病毒、小RNA病毒和冠状病毒；健康人体粪便中检出过单链RNA病毒、单链DNA病毒、双链DNA病毒以及逆转录病毒等，包括多种病毒如anellovirus、picobirnavirus和parechovirus，而博卡病毒、C组和F组腺病毒、Aichi病毒、星状病毒、轮状病毒等则较少检出。还有部分为植物病毒，可能与膳食来源有关。另外，70%的健康人血浆中可能有非致病性的anelloviruses，一些人疱疹病毒如EB病毒、CMV、HHV6、HHV7也经常出现在血液中。疾病状态下，血液中可能出现其它种类的病毒：如淋巴瘤或肉瘤(EBV、HHV8)，脑炎(HSV、CMV、EBV和HHV6)，消化道症状(CMV、HHV6)[17-20]。
不同于上述横断面调查，美国宾州大学的研究团队[21]为了研究人类肠道中病毒组的进化，在2.5年内对一名健康人连续采样16次，获取了24份粪便样品。通过Illumina公司HiSeq2000平台的深度宏基因组测序，得到560亿病毒序列数据，拼接后共有478个contigs，其中60个contigs能够组装成环状，意味着得到了这些病毒全部环状基因组。87%属于未知病毒，13%属于以下噬菌体科(Microviridae、Podoviridae、Myoviridae、Siphoviridae)。进一步分析还发现，其中80%基因组在2.5年中长期稳定存在。因此，他们认为，人体肠道中病毒的多样性来自两个方面，少部分是广泛存在的病毒组，其余是快速进化的长期病毒组成员。
2.4指导临床治疗及转归一些病毒感染机体之后，病毒和宿主之间的相互作用，会导致病毒基因组部分位点发生变异，以逃逸免疫系统对病毒的清除。而在机体接受抗病毒药物治疗的过程中，一些病毒可能在药物作用靶位产生突变，从而对这类药物具有耐药性。甚至有的流行毒株，本身有可能就对部分药物耐受。这些位点如果突变频率不高，采用传统的毛细管电泳测序很难捕捉到。只有覆盖靶基因位点达数十倍甚至上百倍的深度测序，才能清晰展现突变位点，为临床治疗提供及时有效的参考依据。目前这方面的应用，主要集中在HIV、HCV感染患者的抗病毒治疗方面。
1)长期接受抗逆转录病毒药物治疗患者体内的HIV整合对于HIV感染患者，主要采用联合抗逆转录病毒治疗(cART)来抑制病毒的复制，而患者体内持续存在的被感染细胞是阻碍HIV感染治疗的关键。为了探索HIV前病毒DNA在人类基因组的整合位点，美国国家癌症研究所(NCI)的科学家[22]对5名长期(7.2～14.5年)接受cART治疗的HIV感染者进行了观察。通过提取患者外周血单核细胞(PBMCs)或CD4+T细胞的DNA，在MiSeq平台测定患者基因组DNA中病毒/宿主序列的连接点和突破点。他们发现患者治疗前及刚参加cART的时刻，体内存在多个病毒群体；而经过长时间的cART治疗(平均11.7年)之后，无论在DNA水平还是在RNA水平，都出现相同的病毒序列。5名患者中，累计发现的整合位点涉及985个不同基因。以上结果说明HIV的整合位点对于患者体内感染细胞的克隆化扩散以及持续存在发挥了重要作用。
2)复杂的HCV基因型[23]HCV分为7个基因型及67个亚型，不同基因型之间存在30%核苷酸序列差异，不同亚型之间差异达20%。目前HCV感染的治疗方案取决于基因型，因此准确区分基因型至关重要。研究人员选择了世界各地2363例患者中，有12例INNO-LiPA分型属于基因型2，而NS5B序列分型却属于基因型1的患者，首先对其中8例用传统测序方法测病毒核心区序列证实为基因2型。然而，他们随后利用MiSeq平台测定病毒基因组序列发现，这些病毒实际属于重组基因型2/1。其中11株病毒重组区域发生在NS2/NS3交界处。这些患者对索非布韦/利巴韦林治疗方案的应答则类似于基因1型患者。
3)HCV耐药性评估模型[24]为了计算药物对病毒群体的作用以及群体对个体变异的抗性，研究人员选择了HCV和干扰素抗性作为证据。他们选择16名未接受过任何治疗的基因1型慢性HCV患者，注射IFN-α后48h内采血9次。然后扩增病毒基因组E1/E2交界处包含HCV高变区1(HVR1)区域的309nt片段，将PCR产物进行GSFLX平台测序，共测定1.7M片段，平均每个时间点有12332个片段。根据出现变异的频率变化及病毒群体滴度改变计算出干扰素抗性系数，认为病毒群体抗性在IFN-α2a/利巴韦林治疗第12周和抗干扰素变异的出现高度相关。因此认为，该方法能够在短时间内准确评估因单纯病毒滴度变化或者相对病毒变异频率引起的药物抗性。
3小结与展望
综上所述，经过这10年的持续发展，NGS技术和实验体系日臻完善，在临床病毒学的多个领域得到了应用。尽管与10年前相比，测序成本下降了许多，但目前的NGS技术应用还主要局限于研究阶段，离大规模临床应用还有相当远的距离。只有在进一步降低实验成本的前提下，实验室技术人员建立起可行的标准化操作方案，生物信息学人员及时提供合理可靠的分析结果，让临床医生能够正确理解NGS数据，并充分认识到NGS技术为患者带来的便利，NGS平台才能真正进入临床，早日服务于需要的患者群体。
第3篇：病毒学实验技术课程教学改革初探
周玉柏、杨怡姝
摘要：病毒学实验技术是研究病毒及抗病毒药物的重要手段和工具。笔者结合多年教学经验，并在借鉴兄弟院校相关课程的经验基础上，在教学内容，教学形式及考核方式等方面对病毒学实验技术课程进行了改革，以期获得更好的教学效果。
关键词：病毒学；实验技术；教学改革
随着科学技术的飞速发展，新的诊疗手段不断涌现，许多以往无法治疗的疾病也有了新的控制手段，人类的整体健康水平也达到了一个新的高度。然而，病毒这一类古老的微生物仍然严重威胁着人类的健康。新千年以后，肆虐全球的禽流感疫情，埃博拉疫情，我国的SARS疫情均造成了重大了生命及经济损失。研究病毒的特性并开发新的诊疗手段仍然是当前科学研究的热点。病毒学实验技术是开展病毒学研究的基础技术前提。为进一步提高本学院研究生的研究能力，依托学院抗病毒药物研究的特色方向，我们面向生物技术专业研究生开设了病毒学实验技术课程。作为工科院校，在教学资源以及学生基础方面与医科院校相比存在较大差异，现有的教材及实验安排并不完全适用。我们针对教学中存在的问题对课程内容，教学方式以及考核方法进行了初步改革，以期获得更好的教学效果。
一、病毒学实验技术课程教学中存在的问题
病毒学实验技术课程的开设门槛较高，可借鉴的经验也较少。由于学院的专业特色为抗病毒药物研究，因此非常有必要在研究生中开设病毒相关实验课，以使学生在进入课题组开展课题研究之前就能掌握基本的病毒学实验技能，更好地完成后续的研究工作。虽然本科室老师对于该课程的教学改革也进行了前期探索，但在教学过程中仍然存在若干问题：首先，对实验中涉及的生物安全问题的讲解过于偏重理论，实操性不足：病毒属于具有传染风险的微生物，因此强化生物安全教育尤为重要，以往教学过程中只是对学生进行生物安全的理论讲解，学生对于生物安全的认识仅仅停留在熟悉层面上，在实验过程中仍然存在风险处置不合理，操作不规范的问题。因此，有必要在课程内容以及教学方式上进行改革，以加深学生对生物安全的认识，并切实提高其风险处置能力。其次，在实验内容的选择上对于病毒学的特色突出不够：病毒学实验涵盖范围十分广泛，会应用到包括细胞冻存，复苏，传代以及细胞转染等实验技术。然而，上述实验与分子生物学及细胞生物学的实验有重叠，如果在病毒学实验技术课中也纳入上述实验就会导致“病毒学”的特色不够鲜明。因此，有必要结合本学院的学科方向对课程内容进行取舍，以更契合病毒学实验的课程特点。再次，教学方式较为单一：课堂讲解及实验操作的传统教学方式已不能满足当前教学的需要，课堂气氛较为沉闷，学生主观能动性并未得到充分调动。最后，实验考核方式单一：单纯提交实验报告为考核方式并不能全面考察学生的病毒学实验技能，需要在此基础上进行相应的改革。
二、病毒学实验技术课程教学改革初探
对于病毒学实验技术课教学过程中存在的上述问题，我们尝试进行了针对性的改革。首先，对病毒学实验中涉及的生物安全问题，我们在常规的课堂讲解及观看生物安全教育视频的基础上，在每次课程开始前都穿插安排了一系列与本次实验相关的生物安全模拟操演，比如，在转移病毒悬液以及离心过程中如何正确操作以避免有害气溶胶的播散，同时，通过模拟相关实验中可能出现的突发场景，让学生进行现场处置，并在此过程中指出可能存在的错误，并告知正确的处理方法。比如，我们模拟病毒原液洒落在超净工作台上或遗洒在地面上，让学生进行相关处置，让其比较两种处置方法的差异并讲解其中的原理。此外，我们还对实验中的个人危害处置进行了重点演练，比如，病毒悬液飞溅入眼，如何进行应急处理，病毒接触了伤口如何处置等，通过不断的模拟演练，不仅增强了学生在实验过程中的生物安全及个人防护意识，更重要的是提高了学生应对各种突发情况的处置能力，这对于学生日后顺利开展课题研究打下了坚实的基础。其次，对于实验内容的取舍上，我们去除了和细胞生物学和分子生物学有重复的一般实验技术，重点开展了和病毒学联系紧密的诸如病毒感染，CPE观察，病毒滴度测定等一系列实验，以突出本课程的病毒学特色。课程教学方式上，通过借鉴兄弟院校教改的经验，我们在传统课堂讲解的基础上增加了探究式教学方式，针对每位研究生未来的课题方向，指导其查阅文献，归纳整理相关数据，充分调动其主观能动性，自主设计课题实验，使其不仅学到具体的实验技能，还能初步掌握基本的科研思路。在考核方式上，除了传统的实验报告以外，还增加了演示汇报环节，通过提出相应的研究需求，让学生自行选择合适的实验技术，自主设计实验方案，并以PPT形式进行汇报，在考核学生实验技能的同时，进一步考察学生提出问题，解决问题的能力，以实现对学生综合能力的评估。
三、小结
病毒学实验技术在病毒基础研究及抗病毒药物研发中发挥着重要作用。然而，目前在国内面向研究生开设病毒学实验技术课的学校并不多，可供借鉴的经验也很有限。笔者针对教学实践中暴露出的若干问题，尝试从教学内容，教学方式以及考核形式等几个方面进行改革，以强化学生的生物安全意识和应急处置能力，突出病毒学实验技术的课程特点，在训练基本的病毒实验技能的同时，还着力培养学生的基础科研思维，以进一步提高病毒学实验技术课程的教学质量，为培养新时代病毒学研究的专业人才贡献力量。
第4篇：丙型肝炎持续性病毒学应答的研究现状与挑战
万伦，瞿光成，涂兵
（重庆医科大学附属第二医院肝胆外科，重庆400010）
摘要：丙型肝炎病毒（hepatitiscvirus，HCV）从发现到单用干扰素治疗，到普通或长效干扰素联合利巴韦林（ribavirin，RBV）治疗，再到如今直接抗病毒药物（direct-actingantiviralagents，DAAs）的发现，已经取得了令人瞩目的成绩。HCV治疗的目标是获得持续性病毒学应答（sustainedvirologicalresponses，SVR）。现在HCV治疗后获得SVR率从最初的10%左右提高到了90%。随着获得SVR病例的逐渐增多，对SVR人群的探讨越来越多。本文就HCV患者获得SVR方法、影响因素和预后的研究现状进行简要论述。
关键词：丙型肝炎病毒；持续性病毒学应答；影响因素
丙型肝炎病毒（hepatitiscvirus，HCV）感染仍是导致肝癌和肝硬化的主要原因之一。目前全世界有1.85亿人感染HCV，其中80%～85%的HCV感染者发展为慢性丙型肝炎[1]。每年由HCV感染导致的死亡人数约35万[2]。聚乙二醇干扰素（pegylated-interferon，PEG-IFN）联合利巴韦林（ribavirin，RBV）是目前治疗丙型肝炎的标准治疗方案，其持续性病毒应答率（sustainedvirologicalresponses，SVR）可以达到70%。此后直接抗病毒药物（direct-actingantiviralagents，DAAs）的发现，将SVR率提高至近90%。虽然越来越多的人获得SVR，新形势下的HCV抗病毒治疗同样面临挑战。另一方面，经抗病毒治疗后获得SVR虽然可以延缓肝纤维化进程，降低肝癌发生率，但它的长期预后仍然有待进一步讨论。
1丙型肝炎获得SVR治疗进展
1.1基于干扰素的抗病毒方案HCV的治疗目标是永久性清除病毒，即长期随访HCVRNA定量检测结果低于最低检测值下限。持续性病毒学应答（SVR）是指24周后随访HCVRNA结果低于检测值下限。大约20%～30%的HCV感染者可以通过自身免疫系统清除体内病毒[3]，其余HCV感染者仍需通过抗病毒治疗获得SVR。自1896年干扰素被应用于丙型肝炎治疗后，丙型肝炎的治疗经历了普通干扰素单药治疗，普通干扰素或长效干扰素和利巴韦林（RBV）联合治疗，到现在的直接抗病毒药物（DAAs）治疗三个阶段。长效干扰素相对于普通干扰素作用时间长、耐受性和药效好、不良反应少，在丙肝抗病毒药物发展中具有里程碑意义。尽管聚乙二醇干扰素（pegylated-interferon，PEG-IFN）联合利巴韦林现作为国际公认的治疗丙肝的标准方案，其持续性病毒应答（SVR）也仅在70%左右。且不同基因型和病毒负荷也极大地影响了其产生持续性病毒应答率，在欧美人群中，基因2、3型持续性应答率远远高于基因1型[4]。
1.2DAAs药物2011年，美国FDA批准了非结构蛋白NS3/4A蛋白酶抑制剂（proteaseinhibitor，PI）药物应用于基因1型丙肝患者中。其后DAAs药物，包括NS5A抑制剂和NS5B核苷与非核苷聚合酶抑制剂等陆续被发现。NS5B由于它的作用机理和对NS5BRNA聚合酶活性部位的保护，其治疗范围覆盖所有基因型，且具有基因高屏障[5]。DAAs药物的应用可使SVR提高到近90%[6]。目前DDAs药物的使用主要集中于欧美，亚洲国家。由于基因型构成不同，PEG-IFN与RBV联合治疗在亚洲人群中的应答率比较高，仍作为主流治疗方案被应用于临床。
1.3未来抗HCV药物研究展望未来的抗病毒药物研究将主要围绕DDAs药物进行，尤其是针对难治性丙型肝炎的药物治疗，包括DDAs的全口服、无INF鸡尾酒疗法、DAAs的二联、三联治疗等。虽然DAAs让丙肝患者看到了治愈的曙光，但依然有问题待解决。首先是使用DAAs药物后获得持续性免疫应答的远期疗效目前缺乏大样本随机对照研究。其次是针对首次抗病毒治疗失败、合并失代偿期肝硬化或HIV、肝移植后患者的抗病毒治疗需进一步探索。最后是DAAs药物现目前在我国费用昂贵，如何在我国推行既符合国情又合理有效的抗病毒方案有待进一步研究。
2丙型肝炎获得SVR的影响因素
除了不同药物会影响应答率以外，病毒的因素和宿主自身因素同样会影响持续性应答率。如前所述，HCV基因型可影响应答率。HCV根据核苷酸序列组成不同分为6个基因型。标准治疗方案下，基因1、4型应答率在50%左右，而基因2、3型可达80%[7]。此外，病毒载量也可以影响SVR率。一项纳入基因4型人群的前瞻性研究表明，高病毒载量（HCVRNA＞2×106copies/ml）SVR率为55%，而低病毒载量患者达SVR率到了86%[8]。宿主自身因素方面，多项研究提示，宿主的IL28B基因多态性影响持续病毒应答率[9-12]。两个单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）位点（rs12979860和rs8099917），与IL28B基因产生不同应答率密切相关。其中，rs12979860编码IFN-λ3，参与抗病毒免疫，并显著影响抗病毒效果。IL28B分三种基因型：纯合子（CC型）、杂合子（CT型）和未携带该基因（TT型）。既往研究表明：不同IL28B基因型SVR率不同，CC基因型患者丙型肝炎病毒清除明显高于CT和TT型。Falleti等指出CC型在HCV基因2、3型中多于基因1型[13]。同样有研究指出，IL28B与基因型之间的交叉联系可能是导致非洲裔美国HCV患者低应答率的原因。另外有研究发现，在取自肝移植患者中的肝组织中，表现为肝硬化的患者多是TT型患者[14]。IL28B的基因多态性与肝硬化程度、HCV基因型的关系有待进一步研究。除以上因素外，宿主抗病毒治疗前的肝纤维化程度、是否存在胰岛素抵抗、年龄、肥胖（BMI≥40）等也可能影响抗病毒治疗效果。
3丙肝持续性病毒学应答（SVR）预后
研究表明，获得SVR后患者的死亡率、肝癌发生率和肝移植率明显下降，肝硬化进展速度明显减缓，肝外并发症明显减少。一项纳入过去发表的7个研究的综述发现[15]：HCV病毒清除可以减轻肝脏炎症和纤维化。7个研究均表明，实验者经抗病毒治疗并获得SVR后，肝硬化程度比治疗前改善。其中的一项研究结果提示SVR为肝纤维化改善的唯一预测因子[16]。另外，在一组平均随访时间为8.4年，样本量为530例，经干扰素单药、或干扰素与利巴韦林联合治疗患者的临床研究中，SVR人群的原发性肝癌发生率比非SVR人群明显减低（HR=0.26，P＜0.001）[17]。
HCV患者的肝外表现包括冷球蛋白血症、B细胞淋巴瘤、皮肤表现（如皮肤卟啉病）、自身免疫性疾病、HCV相关关节炎等。肝外症状指HCV感染者表现为疲劳、恶心、腹部或肌肉骨骼疼痛、体质量减轻和神经精神症状，包括抑郁、易怒等[18]。这些症状可以通过抗病毒治疗得以改善。还有研究表明丙肝患者的2型糖尿病发生率明显上升，从而引起肾脏损害和心血管事件[19]，不仅如此，丙型肝炎还伴随着低胆固醇血症、胰岛素抵抗（insulinresistance，IR），这些统称为HCV相关的代谢紊乱综合征（HCVassociateddysmetabolicsyndrome，HCADS）。在一项研究中，AraseY等对纳入的2842的患者样本进行回顾性分析，平均随访时间6.4年，发现没有获得SVR患者2型糖尿病发生率是获得SVR患者的2.73倍（95%区间1.77～4.20，P值＜0.001），由此说明经抗病毒治疗获得SVR可以改善胰岛素抵抗，并降低发生肝外并发症的风险。
4SVR即治愈？
4.1SVR人群也可发生HCC虽然获得SVR可以明显改善HCV感染者生活质量，降低肝内外并发症发生率。但是获得SVR患者仍然存在发生肝癌风险。表1中列举了近年来发表的探索SVR人群中发生肝细胞肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）危险因素的15个研究。所有研究均为回顾性队列研究，样本量232～10738人。表格中HCC在获得持续性病毒应答人群的发生率0.9%～6.2%。研究SVR人群引起肝癌发生的危险因素包括：纤维化程度、BMI大小、性别、年龄大小、血小板数目、基因型、糖尿病、嗜酒、甲胎蛋白（AFP，α-fetoprotein，AFP）值高低。其中El-Serag等[20]以美国退伍军人人群为研究人群，经过平均33.6个月的随访，最终100人（样本量1037人）发生HCC。在危险因素分析中，治疗前有肝硬化患者发生HCC率明显高于无肝硬化患者（HR=6.686，95%区间4.319～10.35）。另外，在Hung[21]等建立人的多因素分析模型发现，糖尿病仅在无肝硬化的SVR人群中是发生HCC的危险因素（HR=4.32，95%区间1.23～15.25）。
4.2SVR人群发生HCC可能机制SVR人群发生HCC的内在原因可能有以下几点：①在研究纳入的SVR人群中，存在发病隐匿的微小肝癌患者。但这无法解释为何部分患者虽早期经抗HCV病毒治疗获得SVR，依然发展为HCC。②肝硬化的残留致癌效应：肝硬化引起肝脏组织结构和血管改变，在这种肝脏组织发生变化的背景下，肝细胞增值和细胞周期调控失调，从而导致HCC发生。这解释了肝硬化SVR患者发生HCC率明显高于非肝硬化SVR患者，也可能是SVR患者发展为HCC的主要机制。③持续性的肝脏坏死炎症。糖尿病胰岛素抵抗、酒精等引起的肝细胞坏死炎症可能作为致癌因素参与HCC的发生，另外肝细胞坏死炎症导致的纤维化修复机制可能也是HCC形成原因。炎症、纤维化和肝癌形成的相互作用有待进一步研究。
5总结和展望
从干扰素被发现到如今的DAAs药物的应用，HCV抗病毒治疗获得了重大进展。越来越多的HCV患者能够经抗病毒治疗获得持续性病毒学应答，其中病毒和宿主自身因素导致了不同人群抗病毒治疗效果不同。另外，对于难治性HCV，复发HCV，合并肝硬化、HIV或HBV等复杂性HCV的抗病毒治疗仍然需要进一步研究。虽然获得SVR后的患者发生肝硬化、肝癌或者肝外并发症等风险将大大降低，但并不是等于完全消除，仍有存在发生HCC的风险。肝纤维化、糖尿病、嗜酒是目前较为明确的获得SVR患者发生HCC的危险因素。欧洲肝脏医学会指南上要求对于晚期肝硬化患者，即使经抗病毒治疗获得持续性病毒学应答，仍需进行6个月一次的腹部彩超检查。在我国，对于肝硬化患者的随访率随地区医疗水平而参差不一。建议未来针对SVR人群建立风险评分，对于评分后HCC高风险患者进行每半年一次的腹部彩超检查。随着SVR人群的增多，更大更长随访时间的样本会越来越多，今后的研究重点将会逐渐转向获得SVR后发生HCC的影响因素的研究。
