摘要：目的 利用转基因小鼠探究牙周膜内Gli 阳性(Gli1+)细胞的表达分布以及Gli1+细胞在牙周组织发育过程中的作用。方法 收集3、6和8周龄Gli1lacZ/+小鼠下颌骨,通过β-半乳糖苷酶组织化学染色(X-gal染色)观察牙周膜内Gli1+细胞的时间和空间分布特点。然后,通过注射他莫昔芬诱导3周龄Gli1-CreERT2/+;R26RtdTomato/+小鼠表达红色荧光蛋白tdTomato,对Gli1+细胞及其子代细胞(tdTomato+细胞)进行动态追踪。结果 3周龄小鼠牙周膜内分布大量Gli1+细胞,随着年龄的增长,Gli1在牙周膜内的数量逐渐减少(P<0.05)。tdTomato+细胞随着诱导时间的延长,数量逐渐增加(P<0.05),且逐渐分化成熟为成纤维细胞、牙骨质细胞和骨细胞。结论 牙周膜内Gli1+细胞具有多向分化的潜能,是牙周组织发育过程中重要的细胞来源。
关键词：Gli1 牙周组织 发育 谱系示踪 干细胞
牙周炎是发生在牙支持组织的慢性感染性疾病,是成人牙缺失的首要原因[1]。牙周炎治疗的目的是消除炎症,阻止病程进一步发展,并最终实现牙支持组织(牙周膜、牙骨质和牙槽骨)的再生[2]。探究牙周组织发育的细胞来源对实现牙周组织再生具有重大意义。
自20世纪以来,细胞谱系示踪(cell lineage tra-cing)技术已成为研究特定类型细胞在生长发育、疾病以及组织损伤修复中的作用的有效手段。目前,细胞示踪技术主要基于Cre-loxP同源重组系统。该技术通常将特定启动子驱动的Cre工具小鼠和报告基因小鼠结合使用。特异性表达的Cre重组酶可对loxP位点之间的终止序列发挥剪切作用,从而激活报告基因在特定类群细胞中表达。由于该修饰在DNA水平上进行,因此可以遗传到其子代细胞,从而实现对特定类群细胞的永久标记[3]。通过观察荧光信号可对特定细胞及其子代细胞的增殖、分化及迁移等进行动态追踪。基于此,细胞谱系示踪技术在研究体内干细胞分化命运等领域获得广泛应用[4-6]。
刺猬信号通路(hedgehog signaling)在胚胎发育、器官形成和组织修复过程中均发挥着重要的作用[7]。Gli1作为刺猬信号通路中一个重要的转录因子,已经被多项研究证实为干细胞可靠的体内标志物[8-10]。本研究旨在通过细胞谱系示踪技术实现对表达Gli1阳性(Gli1+)的细胞的动态追踪,分析其在牙周组织发育过程中的作用,以期为牙周组织再生治疗提供新的思路。
1材料和方法
1.1 实验动物
基因型为Gli1lacZ/+、Gli1-CreERT2/+;R26RtdTomato/+的转基因小鼠(各15只)由美国得克萨斯A&M大学牙学院冯健全教授惠赠。实验小鼠饲养于恒温(22 ℃)动物房,昼夜节律为12 h/12 h。
1.2 主要仪器
冰冻切片机、激光共聚焦扫描电子显微镜(Leica公司,德国),荧光显微镜(Nikon公司,日本)。
1.3 主要试剂
他莫昔芬(tamoxifen)、多聚甲醛(paraformal-dehyde,PFA)、戊二醛(glutaraldehyde)、抗原修复液(Sigma-Aldrich公司,美国),抗原封闭液(Vector公司,美国),DMP1抗体(美国得克萨斯A&M大学牙学院冯健全教授惠赠),Periostin抗体(R&D公司,美国),Alexa Fluor 488标记的兔抗羊多克隆抗体IgG、羊抗兔多克隆抗体IgG(Life Tech-nologies公司,美国),DAPI染色液(Invitrogen公司,美国)。
1.4 β-半乳糖苷酶组织化学染色(X-gal染色)观察
取3、6和8周龄Gli1lacZ/+小鼠下颌骨,于0.5%戊二醛溶液中4 ℃过夜固定后放入10%EDTA(含2 mmol·L-1MgCl2)中脱钙,然后30%蔗糖溶液(含2 mmol·L-1 MgCl2)脱水,OCT包埋后行冰冻切片,切片厚度为10 μm。染色前将切片置于4℃ PBS中浸泡10 min以去除OCT,0.5%戊二醛固定10 min后用PBS冲洗3次,每次10 min,然后将切片置于X-gal染液中过夜。次日于显微镜下观察,可见表达β-半乳糖苷酶的细胞(即Gli1+细胞)被染成蓝色,然后用核固红(nuclear fast red)染液复染,脱水,封片,观察牙周膜内Gli1+细胞牙周组织发育过程中的表达分布。
1.5 他莫昔芬诱导Cre重组酶活性以及免疫荧光染色检测
通过对3周龄的Gli1-CreERT2/+;R26RtdTomato/+小鼠行腹腔注射他莫昔芬(75 mg·kg-1),诱导Cre重组酶进入细胞核内靶向剪切tdTomato前的转录终止序列,使得表达Gli1的细胞及其子代细胞(tdTomato+细胞)被红色荧光蛋白tdTomato所标记,从而实现对Gli1+细胞的子代细胞的动态追踪。
分别于他莫昔芬诱导后2 d(P23)、21 d(P42)、35 d(P56)采用断颈法处死Gli1-CreERT2/+;R26RtdTomato/+小鼠,取下颌骨于4%PFA 4℃过夜固定。次日将下颌骨移至10%EDTA溶液中脱钙,然后30%蔗糖溶液脱水,OCT包埋后行冰冻切片,切片厚度为10 μm。染色前将切片置于37 ℃中烤干,PBS洗去OCT后于37 ℃孵箱中行抗原修复40 min,PBS洗3次,每次3 min,滴加封闭液,室温封闭1 h后滴加相应一抗,湿盒中4 ℃过夜。次日将湿盒置于37 ℃孵箱中复温30 min,PBS洗3次,每次3 min,滴加相应荧光二抗,湿盒中室温孵育2 h,DAPI染核(呈蓝色),封片。
1.6 统计分析
通过Image J软件对牙周膜、牙骨质和牙槽骨内tdTomato+细胞以及牙周膜内β-半乳糖苷酶阳性(即Gli1+)细胞进行计数。采用spss 17.0统计软件进行单因素方差分析和Dunnett’s检验,检验水准为双侧α=0.05。
2 结果
2.1 Gli1在牙周组织发育过程中的表达分布
X-gal染色结果显示,3周龄小鼠牙周膜内(尤其是根尖1/3)分布大量Gli1+细胞,随着年龄的增长,Gli1在牙周膜内的数量逐渐减少,差异具有统计学意义(P<0.05),提示牙周膜内Gli1+干细胞的数量随着牙周组织发育成熟而逐渐减少(图1)。
2.2 Gli1+细胞对牙周膜发育的作用
图 1 Gli1+细胞在牙周膜内的表达分布
Fig1The expression pattern of Gli1+ cells in periodontal ligament
左:X-gal染色,其中下图(× 200)为上图(× 80)虚线方框所对应的放大区域;右:单位面积Gli1lacZ/+细胞数,**P<0.01,***P<0.001。
他莫昔芬诱导后2 d(P23),牙周膜内仅见少量tdTomato+细胞,这些细胞呈梭形或多角形,体积较小;诱导后21 d(P42),牙周膜内tdTomato+细胞数量和所占比例增加(P<0.05),并分化成熟为长梭形的成纤维细胞,且表达Periostin(红色tdTomato信号与绿色Periostin信号重叠,呈黄色);诱导后35 d(P56),tdTomato+细胞数量和所占比例进一步增加(P<0.05),占到了牙周膜内细胞总数的33.25%(图2)。这提示Gli1+细胞是牙周膜发育过程中的重要细胞来源。
图 2 对Gli1+细胞在PDL发育过程中的动态追踪
Fig 2 Cell lineage tracing of Gli1+ cells during PDL development
左:Periostin免疫荧光染色,下图(× 630)为上图(× 200)虚线方框所对应的放大区域,其中PDL为牙周膜,D为牙本质,DP为牙髓,CC为细胞牙骨质;右上:单位面积tdTomato+细胞数,**P<0.01,***P<0.001;右下:tdTomato+细胞所占比例,**P<0.01。
2.3 Gli1+细胞对细胞牙骨质发育的作用
他莫昔芬诱导后2 d(P23),可见细胞牙骨质开始形成,而此时tdTomato+细胞主要位于牙周膜内或牙骨质表面;诱导后21 d(P42)时,可见细胞牙骨质明显膨大,tdTomato+细胞数量和所占比例增加(P<0.05),部分tdTomato+细胞分化为牙骨质细胞而包被于牙骨质基质中并表达牙骨质基质蛋白Dmp1(红色tdTomato信号与绿色Dmp1信号重叠,呈黄色);诱导后35 d(P56),tdTomato+细胞数量和所占比例进一步增加(P<0.05),占到了细胞总数的70%左右(图3)。这提示Gli1+细胞是牙骨质发育的主要细胞来源。
图 3 对Gli1+细胞在细胞牙骨质发育过程中的动态追踪
Fig3Cell lineage tracing of Gli1+ cells during cellular cementum development
左:Dmp1免疫荧光染色,下图(× 630)为上图(× 200)虚线方框所对应的放大区域,其中PDL为牙周膜,DP为牙髓,CC为细胞牙骨质;右上:单位面积tdTomato+细胞数,*P<0.05,**P<0.01;右下:tdTomato+细胞所占比例,**P<0.01,***P<0.001。
2.4 Gli1+细胞对牙槽骨发育的作用
他莫昔芬诱导后2 d(P23),tdTomato+细胞主要位于牙槽骨周围的牙周膜内,骨细胞内检测不到tdTomato的表达;随着时间的延长,Gli1+细胞来源的细胞逐渐分化成熟为骨细胞,并表达骨基质蛋白Dmp1(红色tdTomato信号与绿色Dmp1信号重叠,呈黄色),tdTomato+细胞在牙槽骨内的数量和所占比例均增加(P<0.05)(图4)。这提示Gli1+细胞是牙槽骨发育的主要细胞来源。
图 4 对Gli1+细胞在牙槽骨发育过程中的动态追踪
Fig 4Cell lineage tracing of Gli1+ cells during alveolar bone development
左:Dmp1免疫荧光染色,下图(× 630)为上图(× 200)虚线方框所对应的放大区域,其中PDL为牙周膜,AL为牙槽骨;右上:单位面积tdTomato+细胞数, **P<0.01;右下:tdTomato+细胞所占比例,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
3 讨论
牙源性干细胞是指一类从牙体或牙周组织中分离提取而来的成体干细胞,主要包括牙周膜干细胞、牙囊干细胞、牙髓干细胞、根尖乳头干细胞及脱落乳牙干细胞[11-14]。目前关于牙源性干细胞在牙和牙周组织发育过程中的多向分化潜能的研究主要依靠体外细胞实验,而体内的研究十分缺乏。
本研究首先通过X-gal染色分析Gli1+细胞在小鼠牙周组织内的时间和空间分布特征。由于编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因被插入到Gli1的启动子下游,使细胞表达Gli1的同时也表达β-半乳糖苷酶,通过X-gal染色后表达β-半乳糖苷酶的细胞即被染成蓝色,从而实现对Gli1+细胞的定位。实验结果显示,Gli1+细胞在牙周膜内主要分布于根尖1/3,且随小鼠年龄的增长Gli1+细胞数量逐渐减少。同时,本研究还观察到Gli1+细胞在根尖牙乳头和牙髓内也有大量分布,且随年龄的增长也呈现逐渐减少的趋势,以上实验结果与关于牙源性干细胞数量和年龄的关系的研究结论保持一致[14-15],提示Gli1可作为稳定、可靠的标志物来反映牙周组织干细胞在发育过程中表达分布的变化。
本研究还通过细胞谱系示踪技术进一步研究了Gli1+细胞在牙周组织发育中的作用。由于小鼠出生后3周时,磨牙牙根牙本质发育已基本完成,细胞牙骨质开始形成,牙槽骨和牙周膜改建较为活跃,因此本研究选择对3周龄Gli1-CreERT2/+;R26RtdTomato/+小鼠进行诱导,从而实现对牙周组织内Gli1+细胞的动态追踪。研究结果显示,Gli1+细胞在他莫昔芬诱导后2 d(P23)时分布较为局限,且细胞形态呈梭形或多角形,随着时间的延长,Gli1+细胞的子代细胞逐渐分化成熟,并参与到牙周膜、牙骨质和牙槽骨的发育中。同时这些细胞的形态也发生了变化,分别与成纤维细胞、牙骨质细胞和骨细胞形态特征相对应,并表达相应的成熟细胞的标志物(Periostin和Dmp1),证实Gli1+细胞具有多向分化的潜能。
综上,本研究证实牙周膜内Gli1+细胞是牙周组织发育的重要细胞来源。本研究可为进一步探究相关基因对牙周膜干细胞分化的调控机制奠定基础,并为牙周组织再生治疗新方法的探索提供新思路。
利益冲突声明:作者声明本文无利益冲突。
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