龚飞凤 周云线
桂林市妇女儿童医院，广西桂林 541001
[摘要]目的 了解桂林地区高危型人乳头状瘤病毒（HPV）感染及亚型分布情况，为预防子宫颈癌前病变、子宫颈癌提供参考依据。方法 采用医用核酸分子快速导流杂交基因芯片技术对2 262例妇女进行HPV-DNA基因结果分析。结果 2 262例妇女中检测出HPV阳性率26.22％，其中高危型感染率较高（19.20％），低危型感染率较低（7.02％）；普通女性中的感染率为18.89％，在宫颈病变患者中的感染率为84.38％，两者相比差异有统计学意义（c2= 457.01，P=0.00<0.05）；不同年龄段HPV阳性检出率不同，呈双峰U形曲线，第l峰位于年轻妇女（20~30 岁），阳性率为24.61％，第2峰位于中老年妇女（51~65岁），阳性率最高51.74％；高危型主要以HPV52、16、58为主。低危型以HPV6、11最为常见。结论 桂林地区2262例女性宫颈HPV感染常见高危型亚型是HPV52、16、58。低危型亚型是HPV6、11。感染年龄趋于年轻化和老年化。桂林地区的HPV感染基因分型符合亚洲人群分布规侓，但有其地区特点。
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关键词 ]人乳头状瘤病毒；基因型；感染率；年龄分布
[中图分类号]R737.33 [文献标识码]A [文章编号]1674-0742（2015）04（b）-0035-03
[作者简介]龚飞凤（1973-），女，广西桂林人，硕士，主治医师，主要从事宫颈病变治疗的临床研究工作。
基础研究和流行病学均已证实感染人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是造成宫颈上皮内瘤变（Cervical Intraepithelial Neoplasia，CIN）以及宫颈癌的重要原因[1]。目前已经有200余种HPV得到了鉴定，其中有30多种亚型会导致宫颈病变[2]。感染不同亚型HPV由于分布的地域性差异，所产生的致癌性和后果也不同[3]。经过世界范围内的研究，由于种族和地理人群的差异，获得的HPV流行状况、感染峰龄和病毒类型也不尽相同[4-5]。该研究通过医用核酸分子快速导流杂交基因芯片技术，对2012年7月—2014年11月间该区感染HPV妇女宫颈和基因亚型的分布进行探析，基本对该地区妇女宫颈感染HPV情况有所了解，为该地区防治妇女宫颈癌、研发疫苗和使用提供依据。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
该研究对桂林市妇女儿童医院妇科门诊就诊及体检共计2262例妇女进行HPV检测。行宫颈液基薄层细胞学（Thinprep Cytology Test，TCT）检测对检测结果阳性者。若HPV结果阳性合并TCT检查异常者要进行阴道镜检查同时在病变处取活检，通过病理检查确诊。患者均来自桂林地区，年龄20~65岁，平均年龄41.20岁。
1.2 仪器与试剂
HybriMax核酸分子医用快速杂交仪；多聚酶链反应（PCR）仪（KP-CT48）；试剂有21种HPV-DNA提取试剂盒、HPV核酸扩增分型检测试剂盒以及PCR+膜杂交法试剂盒。共有21种HPV亚型检测，包括13种高危亚型（16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型），5种低危亚型（6，42，11，43和44型）以及3种中国人群常见亚型（53，66和CP8304型）。
1.3 方法
1.3.1 病理采集和储藏 标本采集要在非月经期进行，先将宫颈口处多余的分泌物用棉拭子清除，使用专用宫颈刷在宫颈内大约2 cm处旋转5圈，然后把宫颈刷头放入有细胞保存液的样本的瓶中储存；放入4℃的冰箱中，3d内进行检测。
1.3.2 提取样本DNA和扩增PCR 充分漂洗宫颈刷头，离心洗脱液（14000r/min离心5min），去除上清液只留管底细胞，然后加入400μL裂解液根据试剂盒说明书进行提取，把抽的DNA样本作为模板实施PCR扩增。扩增程序如下:95℃ 预热9 min，95℃20s解链，55℃30s退火，72℃30 s延伸，循环此过程40次。72℃延伸5min，4℃低温保存。
1.3.3 导流杂交 预热杂交仪和杂交液，将标记有21种HPV基因型寡核酸探针的低密度基因芯片放在杂交平台上，将加热冰浴后的PCR扩增产物添加到检测孔里实施导流杂交；将膜用封阻液封闭，将封阻液后清除后添加AP酶，30℃温育5min。AP酶催化底物中颜色物的生成，从而显示杂交结果，最后排液清洗。
1.3.4 读取结果 膜条上共有21个位点和两个监控点。两个监控点分别监测扩增过程的有效性和杂交过程的有效性，其余21个位点分别对应试剂盒上21个常见HPV病毒类型。阳性为清晰可见的蓝紫色圆点，多个圆点阳性即为多重感染。
1.4 统计方法
用PEMS 3.1统计软件，对两个样本率行c2检验，差异有统计学意义（P<0.05）。
2 结果
2.1 HPV总感染率及不同人群感染率及基因型别分布
2262例妇女中检测出HPV感染者593例，阳性率为26.22％。其中有21种HPV亚型在这593名感染者中被检测出，这当中高危型HPV感染率较高（19.20％），低危型感染率较低（7.02％）。普通女性感染率为18.89％（385/2038），在宫颈病变患者中感染率为84.38％（189/224），两者相比差异有统计学意义（c2= 457.01，P=0.00<005）。2 262例妇女前6位常见高危型HPV分布见表1。
2.2 2262例受检者不同年龄段HPV阳性检出率
2262例受检者不同年龄段HPV阳性检出率见表2。
2.3 HPV感染亚型在各年龄组的分布
高危型HPV感染亚型在各年龄组的分布:20~30岁以HPV52、58、16为主；31~40岁以HPV16、52、58为主；41~50岁以HPV16、52为主；即在 20~30 岁、31~40岁及41~50岁女性中感染亚型虽略不同，但高危型主要以HPV52、16、58为主。低危型以HPV6.11最为常见，在不同年龄组感染率分别为:20~30岁:13.19％（127/963）、31~40岁:8.71％（54/620）、41~50岁:6.28％（29/462）。51~65岁以HPV52、58为主，低危型HPV感染很少，仅检出HPV11型1例。
3 讨论
宫颈癌是女性第二大恶性肿瘤，世界范围内发病率和死亡率仅次于乳腺癌，分别为15.2/10万和7.8/10万[6]。流行病学研究得出CIN 和子宫颈癌与高危型人乳头瘤病毒（HPV）的感染有关[7]。该研究也证实HPV与宫颈病变（包括CIN 和子宫颈癌等）关系密切。HPV的感染率在普通女性中为18.89％（385/2038），而在宫颈病变患者中高达84.38％（189/224），两者相比差异有统计学意义（c2= 457.01，P=0.00<005）。该研究2262例妇女HPV总感染率26.21％，高于世界自然人群妇女的平均水平（10.4％）[8]，也高于我国HPV在普通女性中的感染率为15.71％[9]。可能与我们筛查的是门诊就诊的高危人群有关。在HPV-DNA分型中发现，高危型HPV的感染率最高为19.20％，低危型感染率最低为7.01％，与国内外报道大体一致[10]。
但在不同的国家和地区不同的地理环境和种族之间，感染HPV型别存在差异[11-15]。2010年一项关于亚洲妇女HPV型别分布的数据分析[16]中研究得出东亚地区主要类型为HPV-16、HPV-18、HPV-52、HPV-58、HPV-33、HPV-45、HPV-31型。岑尧[9]等对我国高危型HPV型别分布进行了数据分析，结论:HPV的型别在我国分布也存在一定区域性，全国范围内前6位常见高危型HPV分布依次为HPV-16、HPV-52、HPV-58、HPV-33、HPV-18、HPV-31型。该研究发现前6位高危型HPV分布依次为HPV-52 、HPV-58、 HPV-16、HPV-53、HPV-39、HPV-18。与岑尧等[9]报道的在型别及排序略有不同。其中感染率最高的型为52，占阳性标本中的17.01％，这与多数亚洲国家研究结果基本一致。该研究还显示高危型别HPV-53型出现排第4位。与岑尧等[9]调查显示可能的HPV-53型高危型别在少数民族自治区HPV感染常见型别中出现，排名第4吻合。这可能与桂林地区为多个少数民族聚居有关。
目前已经在全球范围内观察到4种HPV感染具有特定年龄流行曲线模式，第1种为单峰曲线模式，发生于年轻妇女；第2种是双峰U形曲线，第1峰是主峰，在年轻妇女，第2峰为中老年妇女；第3种为所有成人年龄组均为高峰；而第4种模式是所有年龄组的患病率都呈低峰[17]。该研究2262例受检者不同年龄段HPV阳性检出率也存在着两个感染高峰，比较符合第2种模式的双峰U形曲线，所不同的是第l峰位于年轻妇女（20~30岁），并非主峰，其主峰为第2峰，位于中老年妇女（51~65岁）。这可能是因为中老年妇女的激素水平变化或机体免疫力降低引发潜伏期病毒的复活，所以该种感染也就呈现持续性状态的感染。年轻妇女宫颈上皮还未发育成熟，抵抗力较差，再加上过早、过频的性生活以及性伴侣过多等性生活不良习惯更易感染HPV。因此，我们在积极开展筛查年轻妇女宫颈癌同时，也要加强对围绝经期妇女的HPV检测，以便更好的预防宫颈病变，使宫颈癌的发病率有效降低。
该研究显示高危型HPV感染亚型在各年龄组的分布虽略不同，但高危型主要以HPV52、16、58为主，低危型主要以HPV6、11为主，不符合Lee等[18]等报道全世界高危型HPV主要是HPV16和18亚型；与舒宏等[19]报道广西南宁地区高危型主要以HPV16、58和52为主，低危型主要以HPV6、11为主一致。可能与不同的性行为习惯 、各地区种族和民族的遗传特点及人口迁移等因素相关[20]。而广西南宁和广西桂林同属于广西壮族自治区，其各民族发布及人群健康意识等大致相同有关。目前，已投入临床应用的HPV疫苗主要针对HPV高危型的16、18以及低危型的6、11，并非适用于该地区，提示研制52、16及58型三价HPV疫苗能覆盖该地区大部分人群。
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（收稿日期：2015-01-15）
