宫颈脱落细胞HPV DNA及HPV L1蛋白检测的临床价值分析
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2013年9月～2015年9月在解放军第一八〇医院（以下简称“我院”）健康管理中心体检并诊断为宫颈病变的596例患者为研究对象，年龄26～57岁，平均（35.3±2.1）岁。根据宫颈组织病理学结果将其分为宫颈炎（349例）、宫颈上皮内瘤变Ⅰ级（CINⅠ级，78例）、CINⅡ级（59例）、CINⅢ级（63例）及宫颈癌（47例）；根据宫颈液基细胞学结果分为：未见异常细胞（NILM，286例）、意义未明的非典型鳞状细胞（ASC-US，81例）、不能排除上皮内病变的非典型鳞状细胞（ASC-H，94例）、轻度鳞状细胞上皮内瘤变（LSIL，79例）及高度鳞状细胞上皮内瘤变（HSIL，56例）。不同组别患者年龄差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。所有患者均知情同意并签同意书，本研究经我院医学伦理委员会批准。
1.2 标本采集
采样前确保患者不在月经期且近期无阴道用药史。宫颈脱落细胞采集：用消毒棉签蘸无菌注射用水擦拭宫颈口后，采用新柏氏液基细胞专用刷，以宫颈口为中心旋转，顺时针逆时针各旋转周，刷取宫颈鳞-柱状上皮交界处的宫颈脱落上皮细胞，刷头浸入新柏氏保存液中，反复洗涤使细胞尽可能多地浸入保存液中。HPV DNA采样：宫颈刷插入宫颈口，顺时针逆时针各旋转3周，将刷头折断放入保存瓶中，送检。
1.3 检测方法
宫颈细胞经自动制片机制片、染色、封片等步骤制成薄层细胞涂片，由我院病理科医生用TBS诊断系统阅片及诊断。HPV DNA用第二代杂交捕获法进行检测，利用对抗体捕获信号放大，产生光信号经微孔板分辨仪器测量，获得相对光强度，与设置的标准对照值进行比较，≥1为阳性，<1为阴性。HPV L1蛋白采用美国Advanced公司的HPV L1蛋白检测试剂盒进行检测，严格按照说明书操作。
1.4 统计学方法
用spss17.0统计软件对数据进行分析，计数资料以百分率表示，不同宫颈组织间比较比较采用χ2检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 宫颈病理学分组HPV DNA与HPVL1蛋白比较
HPV DNA阳性者共410例，阳性率为68.8%，宫颈炎、CINⅠ级、CINⅡ级、CINⅢ级及宫颈癌中的阳性率分别为61.3%、69.2%、76.3%、84.1%及93.6%。宫颈病变越严重，HPV DNA阳性率越高，组间总体比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。HPV L1蛋白阳性者共275例，阳性率为46.1%，在宫颈炎、CINⅠ级、CINⅡ级、CINⅢ级及宫颈癌中的阳性率分别为57.9%、43.6%、33.9%、20.6%及12.8%。宫颈病变越严重，HPV L1蛋白阳性率越低，组间总体比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。
表1 不同病理学诊断的宫颈组织中HPV DNA
与HPVL1蛋白比较[n（%）]
注：HPV：人乳头状瘤病毒；CIN：宫颈上皮内瘤变
2.2 宫颈液基细胞学分组HPV DNA与HPVL1蛋白比较
在NILM、ASC-US、ASC-H、LSIL及HSIL组中的HPV DNA阳性率分别为57.7%、67.9%、75.5%、86.1%及91.1%。宫颈病变程度越高，HPV DNA阳性率越高，组间总体比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。HPV L1蛋白阳性率在NILM、ASC-US、ASC-H、LSIL及HSIL组中分别为60.1%、50.6%、35.1%、24.1%及17.9%。宫颈病变程度越高，HPV L1蛋白阳性率越低，组间总体比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。
表2 不同细胞学诊断的宫颈组织中HPV DNA
与HPVL1蛋白比较[n（%）]
注：HPV：人乳头状瘤病毒；NILM：宫颈上皮内瘤变未见异常细胞；ASC-US：意义未明的非典型鳞状细胞；ASC-H：不能排除上皮内病变的非典型鳞状细胞；LSIL：轻度鳞状细胞上皮内瘤变；HSIL：高度鳞状细胞上皮内瘤变
3 讨论
近年来，宫颈癌的发病率逐渐升高，且有年轻化的趋势。据WHO统计，2012年88%的宫颈癌新发病例来自发展中国家，其中95%的死亡病例来自发展中国家。相关文献报道，我国每年新发宫颈癌病例约75 000例，死亡约34 000例，分别占世界范围宫颈癌发病率和死亡率的14%和12%[3-4]。国内外均有研究显示，35岁以下女性宫颈癌的患病率呈上升趋势，年轻女性患宫颈癌后的转移率亦逐渐增加[1，3]。宫颈癌主要是由CIN转变而来，但并不是所有的CIN都能转变为癌变，其病理生理学进展有两种转归，约75%患者可自然消退，约25%可在5～15年内进展为宫颈浸润癌[5]。因此，早期诊断排查宫颈癌及其癌前病变具有十分重要的意义。传统的宫颈癌筛查方法主要是靠体检发现宫颈病灶，或表现出接触性阴道出血等临床症状，然后进行醋酸试验及液基薄层细胞、TBS等细胞学检查。但该方法只能对疾病做出排除性诊断，假阳性率和假阴性率均很高，不能提高宫颈癌的早期诊断率[6-7]。目前我国每年新发宫颈癌病例数占世界新发病例的1/5[3]，但我国尚未形成成熟的筛查模式。宫颈癌早期检出率尽管随着临床检测技术的发展逐步提高，但参差不齐的细胞学检测产品使检测的敏感性和特异性离发达国家仍有较大差距。因此，寻找有效的宫颈病变预测指标在宫颈癌早期干预、降低宫颈癌发生率和死亡率中具有重要的临床意义。 大量的流行病学和实验研究数据表明，HPV持续感染是宫颈癌发生的重要条件[8-9]。HPV是已经得到肯定的少数DNA肿瘤病毒之一，有HPV感染的宫颈癌的相对危险性较正常人增加250倍。迄今已经鉴定的HPV有130多种，根据不同的HPV亚型与肿瘤发生的概率高低分为高危型和低危型[10]。高危型的HPV感染是宫颈癌发生的强危险因素，与宫颈癌前病变和宫颈癌的发生密切相关。目前已经明确有90%以上的宫颈癌与HPV感染密切相关，但仅有不到5%的宫颈HPV感染会进展为宫颈癌。HPV感染宫颈上皮细胞后，通过E6、E7促进病毒整合到染色体脆弱区，并抑制P53抑癌基因的活性，从而启动肿瘤的发生发展[11]。Shen等[12]研究发现，HPV异倍体的出现是宫颈癌肿瘤细胞形成过程中的一个重要生物学标志，且HPV DNA的含量对判断细胞良恶性及癌前病变和肿瘤的诊断具有十分重要的意义。张敦兰等[13]在875例宫颈病变的患者中检测出HPV DNA，结果显示宫颈病变程度越重，HPV DNA异倍体阳性细胞数越多。同时宫颈癌变的恶性程度越高，核异质的细胞数越多，细胞增生也就越活跃。WHO认为，HPV检测是目前宫颈癌首选的初筛方法。Ronco等[14]在一项大样本研究中对47 001例女性进行HPV初筛，47 396例女性进行单独宫颈细胞学初筛，结果显示，两种筛查方法在第一轮筛查中宫颈癌的检出率相似，而第二轮筛查（间隔2～3年）中HPV组未检出宫颈癌新发病例，但细胞学组检出9例新发病例（P = 0.004）。Cuzick等[15]通过以HPV检测为主的研究发现，若HPV初筛为阴性，6年后宫颈病变的发生率仅为0.27%，低于细胞学的0.97%，说明HPV的检测效能优于细胞学检查。若检测发现HPV持续感染，可行阴道镜检查，了解病变区域的毛细血管分布、移行带区域上皮及血管网缠绕的异型上皮，然后在病变区域行活组织检查，通过组织病理学确诊。若肉眼未见明显病变区域，可选择在宫颈移行带区的3、6、9、12点方向处行活检以提高确诊率。2013年美国癌症协会更新指南建议：小于21岁的女性不需进行筛查，21～29岁需每3年行细胞学筛查，30～65岁者每5年行细胞学和HPV联合筛查，大于65岁者若连续2次细胞学联合HPV筛查阴性，可以停止筛查[10]。用HPV DNA检测宫颈病变灵敏度较高，且可避免反复宫颈活检引起损伤，逐渐为临床医生所接受。但人群中HPV感染率较高，且大多数HPV感染为自限性，可在一段时间后自行转阴。因此，如果单用HPVDNA检测宫颈病变，特异性不高，容易造成过度治疗。
HPV L1蛋白是参与HPV病毒形成的一种衣壳蛋白，当HPV整合到宿主基因后，HPV L1蛋白表达降低[16]。同时，HPV L1蛋白还是免疫反应攻击HPV病毒感染细胞的主要靶点，能与T细胞及组织相容性抗原结合，激活免疫反应，阻断病毒感染的组织进一步发展为癌。当其表达降低时，被HPV感染的细胞不能被人体的免疫系统及时清除，导致局部病变不断恶化[17-18]。HPV L1蛋白是HPV感染复制早期的结构蛋白，能反映HPV的复制状态，当HPV整合到宿主基因后，HPV L1蛋白的表达下降。另一方面，HPV L1蛋白是人体细胞免疫反应的靶蛋白，当其表达缺失时，被HPV感染的细胞就不能被机体免疫系统有效识别并清除，进而促进上皮细胞恶性转化[19]。因此，HPV L1蛋白的表达情况与子宫颈病变之间可能存在一定的关系。张金伟等[16]对宫颈病变患者行活组织检查，然后用免疫组化的方法检测各种程度宫颈病变组织的HPV L1蛋白，结果显示随着宫颈组织病理学级别的升高，HPV L1蛋白阳性表达率呈现下降趋势。HPV L1蛋白下降说明HPV病毒感染处于游离状态或短期感染，而HPV L1蛋白的缺失说明HPV病毒DNA整合到宿主基因，提示存在HPV的持续感染，机体无法识别与清除病毒，可能引发宫颈病变并向宫颈癌的方向发展[20-21]。程绍云等[22]研究发现在HPV感染的患者中，HPV L1蛋白阳性组的病变持续率和进展率都显著高于阴性对照组。Lee等[23]研究表明，随着患者子宫颈病变程度加重，HPV L1蛋白表达率呈下降趋势，同时该蛋白缺失的低级别宫颈病变容易进展为高级别宫颈病变。
然而，如果单凭HPV L1蛋白来预测宫颈病变的进展，有一定的局限性和不准确性，因为HPV L1蛋白表达阴性既有可能预示宫颈病变向恶变的方向进展，还有可能表示患者无HPV感染。HPV L1蛋白是人体免疫细胞细胞杀伤HPV病毒的攻击位点。当HPV感染人体后，体内表达正常的HPV L1蛋白单体会与CD4+T细胞及CD8+T细胞上的MHC分子形成免疫复合物，激活体内的免疫级联反应，并在宫颈局部形成高浓度的免疫抗体，杀伤并清除被HPV感染的细胞。因此，在HPV阳性的患者中，HPV L1蛋白高表达往往意味着HPV病毒以游离状态存在，而不是已经大范围侵犯细胞。这种情况属于非进展性的病变，发生高级别宫颈病变的概率极低。反之，如果HPV阳性的患者伴有HPV L1蛋白阴性，则有可能减少了机体的细胞免疫反应，表示HPV感染将呈进展趋势，发生CIN或宫颈癌的风险较高。因此，HPV L1蛋白的检测要结合其他检查才能较准确地预测宫颈病变。王家建等[2]筛选了386例高危型HPV感染的妇女，对其进行宫颈病变分级并检测HPV L1蛋白在不同组别的表达。结果显示HPV L1蛋白检测对宫颈病变具有较高的敏感性和阴性预测值，可在一定程度上弥补细胞学检查的不足，特别是对HPV阳性妇女的分流筛查具有重要的临床指导价值。本研究联合检测HPV DNA与HPV L1蛋白在不同程度宫颈病变中的差异，结果显示HPV DNA阳性率在宫颈癌中最高，随着子宫颈病变程度增加，其阳性率呈上升趋势；而HPV L1蛋白在NILM和宫颈炎中的阳性表达率最高，在宫颈癌中最低，随着子宫颈病变程度增加，其阳性率呈下降趋势。二者联合检测，能大幅度提高宫颈恶性病变检测的敏感性与特异性。与上述学者的研究结果相符。
