程 阳1 唐桥斐2 赵丽妮3
1.沈阳医学院病理生理学教研室，辽宁沈阳 110034；2.沈阳医学院沈洲医院耳鼻喉科，辽宁沈阳 110034；3.沈阳医学院药理教研室，辽宁沈阳 110034
[摘要] 目的 探讨缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡和凋亡相关基因表达的相关机制。方法 取体外新生大鼠心肌细胞作为试验样本，将其随即平均分配为四组，A组为对照组，B组为模拟缺血组，C组为缺血2 h后再灌注1h组，D组为缺血持续3 h组。采用TUNEL法对各组样本心肌细胞凋亡情况进行检测，并采用免疫组织化学法对Bcl-2/Bax基因的表达情况进行检测。结果 在心肌细胞I/R后，检测到明显的阳性凋亡细胞，同时D组和C组细胞凋亡指数明显高于B组，差异具有显著性（P<0.05）；免疫组织化学检测结果表明，Bax蛋白表达明显上调，Bcl-2基因表达明显下调。结论 缺血和缺血再灌注均会造成心肌细胞凋亡，同时心肌细胞的凋亡同Bcl-2/Bax基因的表达之间存在一定的相互作用关系。
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关键词 ] 缺血再灌注；心肌细胞凋亡；凋亡相关基因表达
[中图分类号] R541 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）06（b）-0141-02
[作者简介] 程阳（1977-），女，回族，辽宁沈阳人，硕士，讲师，研究方向：心肌缺血再灌注损伤的机制，耳鼻喉疾病的发病机制。邮箱：cy313313@163.com。
相关研究显示，心肌细胞在缺血再灌注过程中，有病理性细胞凋亡现象存在，是细胞死亡在缺血再灌注损伤过程中的主要形式[1]。近年来，关于缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡的研究多为整体研究，由于在体心肌的缺血再灌注模型受到多方面因素的影响，如体液调节、神经调节等，本次研究通过以体外大鼠新生心肌细胞作为研究对象，建立缺血再灌注模型，对缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡和凋亡相关基因的表达进行研究[2]。本次研究于2013年3月—2013年9月期间通过构建大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤模型，通过TUNEL法对凋亡细胞进行检测，采用免疫组织化学法对相关凋亡基因表达状况进行检测，以对缺血再灌注损伤过程中心肌细胞的凋亡现象进行研究探讨，并对相关基因的表达同心肌细胞凋亡之间的关系进行研究，旨在为临床研究提供可靠的证据。现将结果汇报如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
采用Bochringer Mannheim公司生产的TUNEL试剂盒和荧光标记素，以小鼠抗大鼠Bcl-2、Bax单克隆抗体作为一抗，以生物素标记羊抗鼠抗体为二抗，以辣根过氧化物酶标记链亲和素作为三抗，以上均有北京中山公司提供。
1.2 方法
1.2.1 心肌细胞培养选取新生的健康SD雄性大鼠10只（由本地实验动物中心提供），体重（244±11.16）g，日龄1~2 d，将心脏在无菌条件下取出，剪裁心室组织得到若干1~3 mm2均匀小块，使用0.25%胰酶对其进行4次消化处理，手机单细胞悬液并离心，并制备成单细胞悬液，在二氧化碳孵箱中培养45 min后，吸出浓度较高的心肌细胞悬浮液，在小牛血清中培养，将细胞密度调整为5×105个/mL，在在6孔培养板中接种，培养36 h后进行试验。
1.2.2 心肌细胞爬片的制备将制备好的浓度均匀的心肌细胞悬液于六孔细胞培养板中培养，72 h后，改为在无Brdu的0.5%小牛血清DEEM中孵育36 h并进行试验。
1.3 制备缺血再灌注模型
缺血模拟：以模拟缺血液取代常规心肌细胞培养液，在厌氧罐中放入培养板，将5%CO2混合95%N2充入瓶内，持续40 min，以充分排出O2，在37℃环境中进行2 h培养；再灌注模拟：在模拟再灌注液中进行缺氧心肌细胞1h培养。
1.4 心肌细胞鉴定
采用免疫组织化学法联合形态学对心肌细胞进行鉴定。
1.5 实验分组
将培养的原代新生大鼠心肌细胞随机分配为A组（正常对照组），B组（模拟缺血2 h）、C组（缺血2 h后给予1 h再灌注）及D组（持续缺血3 h），每组包括10例细胞爬片。
1.6 TUNEL染色
按照相关操作方法，对各组细胞爬片进行凋亡细胞的检测，以不加TDT酶作为阴性对照，判定标准以核阳性为准，对凋亡指数进行计算。
1.7免疫组织化学法染色
按照ABC法，对各组的心肌细胞爬片进行Bcl-2/Bax免疫组织化学染色。
1.8荧光显微镜观察
将各组心肌细胞制备成细胞悬液，将细胞密度调整为1×107个/mL，加入溴化乙锭、Y啶橙，混合均匀后制备载玻片，并在荧光显微镜下进行观察。
1.9 统计学方法
本次研究采用统计学软件spss 13.0对所有数据进行分析处理，采用平均值±标准差的形式表示计量资料，采用t检验对数据进行相关性检验，P<0.05时认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 心肌细胞鉴定结果
新生大鼠心肌细胞经过3 d的培养，细胞贴壁，其中正常心肌细胞呈现不规则三角形或索性，细胞核居中并呈卵圆形，胞体存在折光性明显，立体感较强，显微镜下可观察到明显伪足，搏动规则，频率80~100次/min，免疫组织化学染色结果表明，细胞纯度在90%以上。
2.2 TUNEL检测及相关基因表达结果
4组心肌细胞胞核均存在明显的程度不同的黄褐色反应，胞浆未染色；4组细胞的胞浆中均存在Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表达，胞浆中存在明显可见的棕黄色颗粒。细胞凋亡指数及相关基因表达结果见表1。
由表中数据可知，缺血模型的心肌细胞的凋亡指数及Bax基因的表达情况均明显高于对照组，Bcl-2基因的表达情况明显低于对照组，差异具有显著性（P<0.05）；其中持续缺血3 h组和2 h缺血后给予1h再灌注组细胞的凋亡指数及Bax基因的表达情况明显高于缺血2h组，Bcl-2基因的表达情况明显低于缺血2 h组，即Bax基因的表达情况存在明显上调，Bcl-2基因的表达存在明显下调。
表14组心肌细胞凋亡指数、Bax/Bcl-2表达统计结果
注：同A组比较，*P=0.000，t凋亡指数=11.271，tBax=27.034，tBcl-2=18.683；同B组比较，**P=0.000，t凋亡指数C=9.243，tBax-C=8.951，tBcl-2-C=6.562； t凋亡指数-D=6.571，tBax-D=1.671，tBcl-2-D=12.809。
2.3 荧光显微镜观察结果
在荧光显微镜下，可观察到A组细胞的细胞形态完整，细胞膜光滑，细胞核居中；其余三组缺血模拟组细胞均存在明显的凋亡表现：细胞膜完整，但存在皱缩现象，胞膜出芽或鼓泡，核固缩，核仁裂解，细胞在细胞膜的内陷作用下被分割为凋亡小体。
3讨论
当前，临床医学和生物学上普遍应用细胞培养技术进行相关研究。部分资料表明，在离体大鼠心肌细胞的缺氧复氧模型中，若心肌细胞存在2 h缺氧，给予1 h复氧后，其功能和结构的改变情况同心肌缺血再灌注模型一致性较高[3]。因此本次研究中采用离体大鼠心肌细胞缺氧复氧模型作为心肌缺血再灌注损伤的模拟，对其病理生理过程进行分析。由于心肌缺血再灌注损伤过程中，会导致机体酸碱平衡失衡及离子浓度改变，对心肌细胞的损伤均会造成一定影响，因此本次研究中采用缺血模拟和溶液再灌注来对缺血和再灌注过程中酸碱失衡和离子浓度变化进行模拟。
研究显示，单纯的心肌缺血和缺血再灌注均会造成心肌细胞的凋亡，目前临床上普遍将细胞凋亡作为心肌缺血再灌注损伤的主要特征，以同单纯缺血无细胞凋亡和缺血性损伤进行区别[4]。本次研究中，采用TUNEL法，对缺血2 h模拟组、缺血模拟2h之后给予1 h灌注组和持续缺血3 h组细胞培养基进行标记，以对阳性凋亡细胞进行统计分析，在荧光显微镜的观察下，三组缺血模拟组细胞均观察到明显可见的细胞凋亡形态结构变化特征：细胞膜完整，但存在皱缩现象，胞膜出芽或鼓泡，核固缩，核仁裂解，细胞在细胞膜的内陷作用下被分割为凋亡小体，表明单纯的缺血和缺血后再灌注均会造成细胞凋亡，同时本次研究显示，续缺血3 h组和2 h缺血后给予1 h再灌注组细胞的凋亡指数明显高于缺血2 h组，差异具有显著性（P<0.05），表明延长缺血时间和给予再灌注，均会加速凋亡过程，对心肌细胞造成进一步损伤。
研究证明，细胞凋亡主要是受细胞内相关的凋亡基因控制，并受到细胞外信号影响，是一种分子调控机制的细胞死亡形式[5]。其中Bcl-2基因组、Fas抗原及抑癌基因p53均同细胞凋亡有关，其中Bcl-2基因组同细胞凋亡的关系最为密切，主要包括Bcl-2等抗凋亡基因和Bax等促凋亡基因，二者通过相互作用对细胞凋亡进行控制[6]。本次研究中，免疫组织化学染色观察结果显示，在对照组（正常心肌细胞组）中，存在一定程度的Bax和Bcl-2基因的表达，在缺血模拟组中，较对照组而言，Bcl-2基因的表达存在明显的下调，Bax基因的表达存在明显的上调，差异具有显著性（P<0.05）。其中，持续缺血3 h组和2 h缺血后给予1h再灌注组细胞的Bax基因的表达情况明显高于缺血2 h组，Bcl-2基因的表达情况明显低于缺血2 h组，差异具有显著性（P<0.05）。这一结果表明，Bax/Bcl-2基因在心肌缺血再灌注损伤过程中参与了细胞凋亡的相关调控过程，主要表现为抗凋亡基因的表达下降，促凋亡基因的表达上升，具体的调控机制仍需做进一步研究。
本次研究通过在细胞水平上对心肌缺血再灌注损伤进行评价，结果显示，细胞凋亡可作为缺血再灌注损伤和单纯缺血性损伤的病理变化特征性形式，其中Bax/Bcl-2基因在细胞凋亡的过程中起着主要的调控作用，因此临床进行心肌缺血再灌注损伤的预防和治疗时，建议对细胞凋亡和相关凋亡基因的表达进行有效干预，从而实现良好的临床疗效。
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参考文献]
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（收稿日期：2014-03-16）
