徐建民黄振林甑云：
深圳市宝安区中心医院广东深圳518102
邰强焦兴元：
中山大学附属第一医院广东广州510080
基于纤维原样蛋白2阳性表达预测重型颅脑损伤病人急性胰腺炎病情的严重程度
徐建民黄振林甑云邰强焦兴元
PREDICTION OF SEVERITY LEVEL OF ACUTE PANCREATITIS IN PATIENTS WITH ACUTE CRANIOCEREBRAL INJURY BASED ON FIBRINOGEN-LIKE PROTEIN 2´S POSITIVE EXPRESSION
XU Jianming, HUANG Zhenlin, ZENG yun, et al
【摘要】目的
检测急性颅脑损伤患者外周血单核细胞(PBMC)和胰腺组织中Fgl2的表达，探讨其预测重型损伤病人急性胰腺炎病情的严重程度。方法
选取重型TBI患者90例，分为重型TBI患者合并轻型急性胰腺炎组（TBI +MAP组）、重型TBI患者合并重型急性胰腺炎组（TBI +SAP组）、单纯重型TBI 组（单纯TBI组），分别用RLISA法检测各组血浆Fgl2浓度，用RT-PCR检测法检测各组胰腺组织和PBMC中Fgl2 mRNA的表达，用Western blot法检测各组胰腺组织和PBMC中Fgl2 蛋白的表达。结果
重型TBI 患者合并重型急性胰腺炎组（TBI +SAP组）与重型TBI 患者合并轻型急性胰腺炎组（即TBI +MAP组），以及单纯重型TBI 组相比，血浆Fgl2浓度有显著性差异（p均<0.01）；三组的胰腺组织和PBMC中Fgl2 mRNA及其蛋白的表达水平相比较，TBI +SAP组Fgl2 mRNA及其蛋白的表达水平较其它两组均有显著性差异（p均<0.01）。结论纤维原样蛋白2阳性表达有助于预测重型颅脑损伤病人急性胰腺炎病情的严重程度。
【关键词】纤维原样蛋白2重型颅脑损伤急性胰腺炎
【Abstract】Objective
To test the Fgl2 expressed in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) and pancreatic tissue of patients with acute craniocerebral injury, in order to predict the severity level of acute pancreatitis in them. Methods
Select 90 patients with severe traumatic brain injuries(TBI) and divide them into 3 groups: severe TBI with mild acute pancreatitis group（TBI +MAP）, severe TBI with severe acute pancreatitis group(TBI+SAP) and severe TBI group(TBI) .Test the concentration of Fgl2 in plasma with RLISA, the Fgl2 mRNA expressed in PBMC and pancreatic tissue with RT-PCR, and the Fgl2 protein expressed in PBMC and pancreatic tissue with Western blot of each group. Results
Compare patients suffered severe TBI and severe acute pancreatitis (TBI+SAP) with the other 2 groups, there ia a significant difference in plasma Fgl2 concentration(p<0.01). Compare patients suffered severe TBI and severe acute pancreatitis (TBI+SAP) with the other 2 groups, there are significant differences in PBMC and pancreatic tissue Fgl2 mRNA and protein expressions(p<0.01). ConclusionFibrinogen-like protein 2´s positive expression contribute to predict the acute pancreatitis´s severity level of patients with acute craniocerebral injury.
【Key words】 Fibrinogen-like protein 2; Severe traumatic brain injuries; Acute pancreatitis
【Author′s address】The Central Hospital of Baoan District,Shenzhen, Guangdong 518102
doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.07.012
器官移植是目前治疗大多数重要器官（肝、心和肺）末期衰竭最为成熟的可用手段。随着现代器官保存技术和免疫抑制技术的进步，如今已有相当比例的病人有望在术后高质量地长期生存。同目前接受移植的病人数量相比，有更多的人本可以从器官移植中受益，但是世界范围的脏器极度短缺已经成为制约器官移植发展的主要问题［1］。我国每年有许多患者因器官供体的严重匮乏，在等待供体的过程中离开人世［2］。在充分借鉴国际器官捐献体系的经验基础上，综合考虑我国国情，国家原卫生部委托中国红十字总会根据《人体器官移植条例》的有关规定，于2010年1月28日专门签署中国人体器官捐献试点工作协议，制定器官捐献“中国标准”，即中国一类(C-Ⅰ)：国际标准化脑死亡器官捐献(Donation after Brain Death，DBD)，中国二类(C-Ⅱ)：国际标准化心脏死亡器官捐献(DCD)，和中国三类(C-Ⅲ)：中国过渡时期脑-心双死亡标准器官捐献(Donation after Brain Death plus Cardiac Death，DBCD)［3］。我们的临床实践表明［4］，急性脑损伤患者是潜在供体的主要来源，但是急性颅脑损伤（traumatic brain injury， TBI）常合并全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）,其系多种因素诱导的一种病理过程，对损伤的脑组织和供体器官功能的恢复有重要影响。重型TBI患者合并全身炎症反应综合征（SISR）发生率为58.11%，并发多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction， MODS）发生率为72.1%［5］。文献报道急性颅脑损伤（traumatic brain injury， TBI）存在胰腺炎，其血淀粉酶（amylase, AMY）明显升高［6］。有学者认为，凝血机制的异常和血栓形成在重型急性胰腺炎（SAP）发病机制中占重要地位［7］，它最终可发展成弥散性血管性凝血（disseminated intravascular coagulation， DIC）和多器官功能衰竭（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）［8］，而急性胰腺炎对供体器官（肝、心、肾）的功能有明显的影响［9］。纤维原样蛋白2（Fgl2）是一种新型的纤维蛋白原，表达于各种类型的细胞，在血栓的形成中发挥重要作用，它能激活凝血酶原酶，继而激发凝血系统，最终形成血栓，导致微循环障碍［10］。本研究检测急性颅脑损伤（traumatic brain injury， TBI）患者外周血单核细胞和胰腺组织中Fg12的表达，探讨其预测重型损伤病人急性胰腺炎病情的严重程度。
1材料和方法
1.1研究对象的选择和标本收集
选择2010年1月~2013年12月入住广东省深圳市宝安区中心医院神经外科和中山大学附属第一医院格拉斯哥昏迷评分(glasglowcoma scale，GCS)3～8分的重型TBI 患者90例为观察对象，分组如下：A组：重型TBI 患者合并轻型急性胰腺炎（mild acute pancreatitis，MAP），即TBI +MAP组，25例，男18例，女7例，年龄22～56岁，平均(43.08±13.18)岁，合并轻型急性胰腺炎：B组：重型TBI 患者合并重型急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP），即TBI +SAP组，26例，男20例，女6例，年龄18～59岁，平均(44.18±14.25)岁，合并重型急性胰腺炎；C组：单纯重型TBI 患者，即单纯TBI组，49例，男40例，女9例，年龄16～54岁，平均(42.92±13.65)岁，不合并伴有胰腺炎。收集上述患者的外周血，分离单个核细胞（PBMC）。急轻重型胰腺炎的诊断符合中华医学会消化病分会胰腺病学组制定的标准。上述患者成为器官捐献供体（DCD）后［11］，在获取器官时自下腔静脉采集全血0.8~1.0 ml(以肝素抗凝)，离心（3 000 r/min， r=22?5 cm，20 min），取上清液置于-80℃冰箱中保存。并且在获取器官时同时收集上述供体的胰腺组织，-80℃保存。患有的患者胰腺组织均经病理学检查以证实胰腺炎。
1.2RLISA法检测血浆Fgl2浓度在获取器官时，自下腔静脉采集全血0.8~1.0 mL(以肝素抗凝)，离心（3 000 r∕min， r=22?5 cm，20 min），取上清液置于-80℃冰箱中保存。按照双抗体夹心ABC-ELISA法，应用人Fgl2 ELISA试剂盒检测血液标本中Fgl2浓度（操作按试剂盒说明书进行）。用酶标仪在450 nm处测定吸光度值（A值），画出标准曲线，测出样品A值），再根据相关公式y=a+bx+cx2+dx3计算出血清Fgl2浓度。其中y为A值，x为Fgl2浓度，a=0.041，b=0.004， c=1.98×106，d=5?21×10-10。
1.3RT-PCR检测法检测胰腺组织和PBMC中Fgl2 mRNA的表达
胰腺组织的处理：将胰腺癌组织标本置于冰块上研磨后，加入0.8 mL Trizol试剂消化；采用Trizol裂解法提取样品总RNA，采用紫外分光光度计检测RNA的含量和纯度。取分离得到的PBMC，同法应用Trizol试剂抽提细胞总RNA（操作均按试剂盒说明书进行）。采用实时定量荧光PCR法（real-time PCR）检测。采用PrimeScriptRT reagent Kit逆转录试剂盒将其逆转录成cDNA后，再采用SYBR Premix EX TaqTM II PCR试剂盒在荧光定量PCR仪（ABI7500 fast）上进行扩增。Fgl2-mRNA引物：上游：5’-CCTGGAGATTGTGGTTTCGTTT-3’，下游：5’-TACCATGCCTTTCTCCAAGGGG-3’，片段长度为164 bp；内参照β-actin引物：上游5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’,下游5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’,片段长度为160 bp。扩增条件：95 ℃ 30 s预变性，95℃ 3 s、60℃ 30 s，45个循环。扩增结束后，根据2-△△Ct法，以对照组△Ct的平均值作为校正值，计算Fgl2 mRNA的相对表达量。
1.4Western blot法检测胰腺组织和PBMC中Fgl2 蛋白的表达
各组胰腺组织和PBMC的处理：各组加入裂解液机械匀浆，4℃离心（16 000×g，15 min）。采用二奎啉甲酸（bicinchominic acid assay，BCA）法测定蛋白浓度。具体方法参照文献［7］。采集图像，以图像处理分析软件进行灰度值测定，以Fgl2蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值的比值作为Fgl2蛋白的表达水平。
1.5统计学方法
采用spss13.0统计软件对实验数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）或中位数表示，比较采用随机区组设计的方差分析或秩和检验。检验水准a=0.05。
2结果
本实验中，重型TBI 患者合并重型急性胰腺炎组（TBI +SAP组）与重型TBI 患者合并轻型急性胰腺炎组（即TBI +MAP组），以及单纯重型TBI 组相比，血浆Fgl2浓度有显著性差异（p均<0.01）；三组的胰腺组织和PBMC中Fgl2 mRNA及其蛋白的表达水平相比较，TBI +SAP组Fgl2 mRNA及其蛋白的表达水平较其它两组均有显著性差异（p均<0.01）。
3讨论
急性颅脑损伤后，特别是广泛性脑挫裂伤高颅内压等作用下，颅内促炎症细胞因子生成大量增加，启动炎性级联反应，引发继发性脑损害脑代谢改变和脑细胞死亡［12］。临床实践证明，急性颅脑损伤后往往合并血清淀粉酶升高，重型TBI患者常伴发严重的SIＲS，机体产生大量的细胞因子和炎症介质对胰腺细胞产生损伤，同时创伤应激时的氧自由基损害和TBI后迷走神经兴奋导致胰腺自身缺血均可诱发急性胰腺炎。急性胰腺炎可引起一系列免疫反应，其中包括凝血系统功能的变化，其中包括胰腺的微循环功能障碍。目前认为巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞激活，引起促炎细胞因子和炎症介质过度释放是胰腺微循环障碍发生的主要机制。
Fg12(fibrinogen-like protein 2∕firoleukin)是一种新近发现的凝血因子，属于纤维蛋白相关蛋白超家族。fgl2凝血酶原通过免疫凝血、纤维蛋白相关沉积及微血栓形成介导缺血性损伤，进一步至组织损伤。本实验中，重型TBI 患者合并重型急性胰腺炎组（TBI +SAP组）与重型TBI 患者合并轻型急性胰腺炎组（即TBI +MAP组），以及单纯重型TBI 组相比，血浆Fgl2浓度有显著性差异（p均<0.01）；三组的胰腺组织和PBMC中Fgl2 mRNA及其蛋白的表达水平相比较，TBI +SAP组胰腺组织和PBMC中Fgl2 mRNA及其蛋白的表达水平较其它两组均有显著性差异（p均<0.01），我们推测在胰腺炎过程中，炎症因子协同刺激人体内单核∕巨噬细胞、胰腺内血管内皮细胞中Fgl2凝血酶原基因，首先在转录水平上表达增高，再进一步增加凝血酶原合成，然后通过激活凝血系统导致胰腺组织微血管内血栓形成，从而促使胰腺坏死发生。
本课题研究表明，纤维原样蛋白2阳性表达有助于预测重型颅脑损伤病人急性胰腺炎病情的严重程度。
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