王君1 曲群2
1.西安交通大学医学院，陕西西安710000；2.西安交通大学二附院妇产科，陕西西安710000
[摘要]目的探讨YAP及CREB蛋白在上皮性卵巢癌组织中的表达情况及其意义。方法采用免疫组化检测2008年1月—2013年12月收治的93例患者，观察20例正常卵巢组织、20例良性卵巢肿瘤及53例上皮性卵巢癌组织中YAP、CREB蛋白的表达情况。结果YAP在上皮性卵巢癌组织中阳性表达率为90.57%，而在正常卵巢组织及卵巢良性上皮性肿瘤仅为50%、65%。CREB蛋白在上皮性卵巢癌组织中的表达情况（77.36％）也高于正常卵巢组织（5%），两者相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论YAP、CREB蛋白可能与上皮性卵巢癌的发生发展密切相关，YAP、CREB在上皮性卵巢癌中的异常表达可为上皮性卵巢癌的诊断、治疗提供实验依据。
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关键词 卵巢癌；上皮性肿瘤；YAP；CREB；免疫组化
[中图分类号]R737.31[文献标识码]A[文章编号]1674-074２（２０１4）12（b）－０033-03
[作者简介]王君（1977-），女，辽宁大连人，硕士，副主任医师，研究方向：妇科。
卵巢癌是常见的妇科生殖器官恶性肿瘤之一，因其部位较深，早期病变不易发现，晚期病例也缺乏有效的治疗手段，5年生存率仅为15％~30％[1]，故而严重的威胁着妇女的健康及生命，该实验对该院2008年1月—2013年12月病理科存档的蜡块93例进行研究，探讨YAP和CREB蛋白在正常卵巢组织、良性上皮性卵巢肿瘤及卵巢上皮性癌中的表达情况，分析其表达的差异性及卵巢上皮性癌临床病理因素间的关系以及两者间的相关性，探讨其在卵巢上皮性恶性肿瘤发生中的作用机制以及它们之间的相关关系，从而有助于为卵巢上皮性恶性肿瘤的早期诊断提供新的分子生物学标志物，同时为临床治疗途径提供一些思路，现报道如下。
1材料与方法
1.1一般资料
选择西安交通大学第二附属医院病理科存档的蜡块93例，其中20例为正常卵巢组织，20例良性上皮性卵巢肿瘤，53例卵巢上皮性癌，其中卵巢上皮性癌患者年龄37~68岁，中位数为56岁，采用免疫组化（SP）法检测YAP和CREB蛋白的表达情况，统计学分析其表达的差异性及与恶性卵巢上皮性肿瘤临床病理因素的关系，同时探讨其二者间的相关性。所有患者术前均未接受放、化学或免疫治疗，所有标本均经该院病理科确诊。
1.2标本的处理
组织标本均用磷酸缓冲液配置的10％中性甲醛固定液及时固定后，进行乙醇梯度脱水，二甲苯透明以及石蜡包埋，4μm厚连续切片。
1.3免疫组织化学实验
（１）兔抗人YAP多克隆均抗体购自美国CST公司，兔抗人CREB多克隆均抗体购自美国CST公司，PBS（0.001M，PH7.4）购自福州迈新生物技术开发有限公司，ＳＰ超敏试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，按试剂盒说明书步骤进行染色，每次试验均设阴性对照，用磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）代替一抗作为阴性对照，以公司提供的阳性片染色作为阳性对照。（２）实验结果判断：①根据阳性细胞所占百分比评分，阳性细胞≤5％为0分，6％~25％为1分，26％~50％为2分，51％~75％为3分，>75％为4分；②染色强度计分以细胞显色反应程度计分：无着色0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；③将阳性细胞所占的百分比分值和染色强度分值相乘为结果：0分为阴性（-），l~4分为弱阳性（+），5~8分为中度阳性（++），9~12分为强阳性（+++）。以购买的阳性片免疫组化染色结果为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照，采用双盲法由两位病理科医生阅片，取其平均值为最终结果。
1.4统计方法
采用ＳＰＳＳ18.0统计软件进行数据分析。χ2检验用于计数资料的比较分析，YAP和CREB的相关分析用Spearman等级分析法。P<0．05为差异有统计学意义。
２结果
2.1YAP、CREB在不同卵巢组织中的表达
在实验中，YAP在正常卵巢组织阳性表达率为50%，YAP在良性上皮卵巢肿瘤的阳性表达率为65％，在恶性上皮性卵巢肿瘤中阳性表达率为90.57%，CREB在正常卵巢组织阳性表达率为5%，在良性上皮卵巢肿瘤的阳性表达率为25％，在恶性上皮性卵巢肿瘤中阳性表达率为77.36%，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2YAP、CREB表达与卵巢上皮性癌临床病理学参数关系
YAP的阳性表达在正常卵巢组织与良性卵巢上皮性肿瘤之间的差异无统计学意义，P>0.05，YAP在组织学中低分化（G3）组中的阳性表达（97.1%）与高中分化（GI-G2）组的表达（77.8%）差异有统计学意义，P<0.05（χ2=5.217，P=0.040）；但YAP在上皮性卵巢癌阳性表达与患者年龄、临床分期及淋巴转移差异无统计学意义（P>0.05）。在正常卵巢组织与良性卵巢上皮性肿瘤之间CREB的阳性表达，差异无统计学意义（P>0.05）。CREB在组织学中低分化（G3）组中的阳性表达（85.7%）与高中分化（GI-G2）组的表达（61.1%）差异有统计学意义，P<0.05（χ2=9.382，P=0.001）；CREB在上皮性卵巢癌淋巴转移中阳性率（77.4%）较I-Ⅱ期（69.2%）有升高趋势，均差异有统计学意义，P<0.05（χ2=5.568，P=0.015）。另外，CREB的阳性表达与患者年龄、临床分期差异无统计学意义（P>0.05）。
2.3YAP和CREB二者表达的相关性分析
该研究显示在正常在卵巢上皮细胞中，YAP和CREB阳性表达率分别为50%和50%，在卵巢上皮性癌组织中YAP和CREB阳性表达率分别为90.75%和77.36，经Spearman秩相关分析发现，卵巢上皮性癌组织中的YAP和CREB表达呈显著的正相关（r=0.442，P=0.001＜0.05），差异有统计学意义。见表2。
3讨论
肿瘤的发生发展是一个多因索、多步骤、多阶段的复杂过程。正常情况下。细胞增生与凋亡之间的动态平衡维持着组织器官正常大小和机体内环境的稳态，而肿瘤的发生发展往往关联于细胞发生异常增殖或凋亡抑制。Hippo信号通路是一种维持增生与凋亡间平衡的信号通路，YAP蛋白是Hippo信号通路中一个起中心作用的蛋白，在细胞正常生长发育过程中，YAP作为一种转录共激活因子通过其PPXY结构域可与转录因子TEAD家族，P73，SMAD家族（BMP通路），Bric2，Bnc5（IAP家族），ErbB4胞质结合域，PEBP2a等结合[2]促进Hippo下游目的基因的表达从而促进细胞生长、抑制细胞凋亡。研究发现YAP基因存在于与多种人类肿瘤相关的染色体1lq22上，因此YAP基因是一种原癌基因[3]。AngelaA等[4]采用免疫组化方法检测了YAP在12例正常卵巢组织及42例卵巢浆液性囊腺癌组织中的表达情况，结果发现YAP在浆液性囊腺癌组中的阳性率（98％）显著高于在正常卵巢上皮细胞的阳性率（50％），提示YAP的过量表达导致细胞增生及凋亡的失衡，直接或间接地参与浆液性囊腺癌的发生。该实验结果同上述结果，并与组织分期有关，提示YAP与卵巢上皮性癌的发生有密切关系。
CREB，即cAMP反应元件结合蛋白，于80年代后期被发现，是PKA重要的下游转录因子。它具有调节基因的转录、生理节奏、细胞的发育与生存、成瘾性和抑郁以及学习记忆等功能[5]。多项研究表明，由CREB参与调控的靶基因在细胞增殖、分化、存活和细胞周期的调控中起重要作用。其过表达能促使细胞存活和增殖，在多种肿瘤的发生中具有重要作用[6-9]。CREB表达水平及磷酸化程度在卵巢上皮细胞及颗粒细胞的生存中也具有重要作用[10]，卵泡刺激素和黄体生成素至少部分是通过cAMP细胞内信号通路调节卵巢的功能。与卵巢癌的发生、发展密切相关[11]。该实验中，CREB与卵巢上皮性癌的组织学分期及淋巴转移有关，提示CREB可能在卵巢上皮性癌的发生、发展以及预后起一定作用。
综上所述，YAP和CREB可能是卵巢癌发生的致癌因素，且都在卵巢癌的发生、发展中起着重要作用，二者在卵巢癌中的表达呈显著正相关，随着肿瘤治疗技术水平分飞速发展，目前致癌基因的研究由单一基因发展到对多个基因协同作用和相互调节机制的研究。癌基因的靶向治疗为临床妇科恶性肿瘤的诊断及治疗开辟一条新的途径，在将来，YAP与CREB可能成为用于早期筛查恶性肿瘤的最新分子标志物，从而为研发新的抗肿瘤药物提供新的思路。
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参考文献
[1]丰有吉，沈铿.妇产科学[M].北京：人民卫生出版社，2010：340-354.
[2]McDonaldCB，McIntoshSK，MiklesDC，etal．BiophysicalanalysisofbindingofWWdomainsoftheYAP2TranscriptionalregulatortoPPXYmotifswithinWBPlandWBP2adaptors[J]．Biochemistry，2011（8）：9616-9627．
[3]LamarJm，StemP，LiuH，etal．TheHippopathwaytarget，YAP，promotesmetastasisthroughitsTEAD-interactiondomain[J]．ProcNatlAcadsciUSA，2012（11）：2441-2450．
[4]AngelaA，Steinhardt，MarianaF，eta1.ExpressionofYes-associatedProteinYAPincommonsolidtumors[J]．HumPathol，2008，39（11）：1582-1589.
[5]BlendyJA，MaldonadoR.Geneticanalysisofdrugaddiction：theroleofcAMPresponseelementbindingprotein[J]．JMolMed，1998，76（2）：104-110.
[6]GubbayO，RaeMT，McNeillyAS，eta1．cAMPresponseelement-binding（CREB）signallingandovariansurfaceepithelialcellsurviral[J]．JEndocrinol，2006，191（1）：275-285．
[7]LeeHY，CrawleyS，HokariR，eta1．BileacidreguhtesMUC2transcriptionincoloncanercellsviapositiveEGFR／PKC／Ras／ERK／CREB，PI3K／Akt／IkappaBandp38／MSKI／CREBpathwaysandnegativeJNK／c-Jun／AP-1pathway[J]．IntJOncoI，2010，36（4）：941-953．
[8]SonJ，LeeJH，KimHN，eta1．cAMP-response-element-bindingproteinpositivelyregulatebreastcancermetastasisandsubsequentbonedestruction[J]．BiochemBiophysResCommun，2010，398（2）：309-314．
[9]ComuzziB，LambrinidisL，RogatschH，eta1．Thetranscniptionalco-activatorcAMPresponseelement-bindingprotein-bindingproteinisexpressedinprostateCancerandenhancesandrogen-andanti-an-drogen-inducedandrogenreceptorfunction[J]．AmJPathol，2003，162（1）：233-241．
[10]PoonSL，AnBS，SoWK，eta1．Temporalrecruitmentoftranscfiptionfactorsatthe3’，5’-cyclicadenosine5’-monophosphate-responseelementofthehumanGnRH-Ⅱpromoter[J]．Endocrinology，2008，149（10）：5162-5171．
[11]LinnerthNM，GreenawayJB，PetrikJJ，eta1．cAMPresponseelement-bindingproteinisexpressedathighlevelsinhumanovarianadenocarcinomaandregulatesovariantumorcellproliferation[J]．IntJGynecolCancer，2008，18（6）：1248-1257．
（收稿日期：2014-09-16）
