石静 梁勇刚
山西医科大学汾阳学院解剖研究室，山西汾阳032200
【摘要】目的：研究穿心莲内酯诱导人HL-60细胞凋亡及相关机制。方法：以人早幼粒白血病细胞株HL-60为模型，作用于HL-60细胞的穿心莲内酯设3.125、6.25、12.5μg/ml三个受试浓度，实验分为溶媒对照组、穿心莲内酯3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml四个组。采用AnnexinV/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率、流式细胞术结合荧光染色检测穿心莲内酯对细胞色素C（CytC）蛋白表达的影响。结果：穿心莲内酯能促进HL-60细胞凋亡，且呈剂量依赖性。穿心莲内酯作用HL-60细胞24h，CytC蛋白表达增加，12.5μg/ml作用浓度与溶媒对照相比有统计学意义（P＜0.05）。结论：穿心莲内酯能诱导HL-60细胞凋亡，其诱导凋亡机制可能与CytC释放的增加、线粒体通路有关。
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关键词 穿心莲内酯；细胞凋亡；CytC
【中图分类号】R285.5【文献标志码】A【文章编号】1007-8517(2015)03-0022-02
1材料和方法
1.1细胞购置及培养人早幼粒白血病HL-60细胞株购于武汉大学细胞保存中心。用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基放置在常规培养箱中传代培养。
1.2样品配置及实验分组根据预实验结果，作用于HL-60细胞的穿心莲内酯（购自天津天士力制药股份有限公司）设3.125、6.25、12.5μg/ml3个受试浓度。用DMSO溶解穿心莲内酯为50mg/ml贮存液，所需浓度在实验前用RPMI1640培养基稀释生成。实验分为溶媒对照组、穿心莲内酯3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml四个组。
1.3流式细胞仪检测穿心莲内酯作用HL-60细胞24h凋亡率把对数生长期的HL-60细胞浓度调整为1×106个/ml，以1ml/孔接种于6孔板内，加入不同浓度的穿心莲内酯，作用24h后离心收集细胞，PBS液洗涤细胞两次，按照AnnexinV/PI双染法（试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司）步骤操作，1h内上流式细胞仪进行检测，实验结果用WinMDIversion2.9软件进行分析。
1.4荧光标记/流式细胞术检测Cytc蛋白的表达细胞的培养、接种、加样品同上。穿心莲内酯作用HL-6024h后收集细胞，800rpm离心5min后，用250μlPBS液清洗2次后重悬细胞于流式管中，加入20μl荧光标记的Cytc（购自Abzoom公司），上流式细胞仪进行检测。
2统计学处理
采用spss11.5统计软件进行数据的统计分析，用x±SD表示所有实验数据，P<0.05为差异具有统计学意义。
3结果
3.1穿心莲内酯作用HL-60细胞24h凋亡定量检测结果显示，和溶媒对照相比，穿心莲内酯各浓度作用于HL-6024h后，各组细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率及坏死率均随着穿心莲内酯浓度的升高逐渐升高，量效关系明显；与溶媒对照相比，中、高浓度早期凋亡率、晚期凋亡率及坏死率差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。
3.2穿心莲内酯作用HL-60细胞24hCytC蛋白表达变化结果表明，与溶媒对照相比，不同浓度的穿心莲内酯作用HL-60细胞24h后，CytC蛋白表达逐渐增加，表明穿心莲内酯作用后CytC从线粒体膜间隙释放到胞浆内的量逐渐增加。见表2。
4讨论
恶性肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一，可发生在任何年龄段，发病率高，预后不良。不断发掘疗效好、毒副作用低的抗癌中草药是研究的新方向。
笔者在前期研究中发现，穿心莲内酯可以抑制人SKOV3、A431、HL-60细胞增殖，并可诱导SKOV3、A431细胞凋亡，其诱导凋亡可能与线粒体膜电位（MMP）下降有关［1-2］。本研究拟在前期研究的基础上，采用AnnexinV/PI双染法流式细胞术检测穿心莲内酯是否能诱导HL-60细胞凋亡、流式细胞术结合荧光染色检测穿心莲内酯对HL-60细胞细胞色素C（CytC）蛋白表达的影响。
Annexin/PI双染法FCM检测结果发现，穿心莲内酯能促进HL-60细胞凋亡，且呈现良好的剂量依赖性；6.25、12.5μg/ml与溶媒对照组相比，早期凋亡率、晚期凋亡率及坏死率差异有统计学意义（P＜0.05）。
细胞凋亡的信号转导机制十分复杂，其中最常见的就是线粒体通路。由该通路启动的细胞凋亡过程受许多蛋白质的调控，以CytC最常见。
CytC是位于正常细胞的线粒体内、外膜之间。在细胞凋亡信号刺激下，CytC可从细胞的线粒体释放进入细胞的胞浆，这是线粒体凋亡通路的关键步骤。在各种刺激因素作用下，线粒体外膜通透性增加、线粒体通透性转变孔（MPTP）持续性开放、MPP逐渐降低，线粒体通透性转变孔开放后，线粒体基质会肿胀，线粒体外膜更易破裂，释放出细胞色素C等膜间蛋白，最终引起细胞凋亡［3］。实验中我们发现，穿心莲内酯作用HL-60细胞24h后，CytC蛋白表达增加，且高浓度（12.5μg/ml）与溶媒对照组相比有统计学意义（P＜0.05）。这一现象表明：穿心莲内酯作用下，可能使HL-60细胞线粒体膜通透性增高，从而使膜间隙蛋白CytC释放增加［4］。
总之，本研究结果表明，穿心莲内酯能诱导HL-60细胞的凋亡。我们对其机制进行进一步研究中发现，在此过程中CytC蛋白释放增加，进而提示穿心莲内酯可能通过线粒体凋亡途径促进HL-60细胞凋亡。
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参考文献
［1］石静，梁勇刚，白慧健，等.穿心莲内酯对SKOV3细胞凋亡及HER2蛋白表达的影响［J］.解剖学杂志，2012，35(1)：20-22.
［2］石静，梁勇刚.穿心莲内酯对人皮肤基底细胞癌A431细胞生长、凋亡及增殖细胞核抗原蛋白表达的影响［J］.解剖学报，2013，44(1)：73-78.
［3］石静，卿晨.线粒体膜电位改变与细胞凋亡［J］.中国民族民间医药，2011，20（7）：20-21.
［4］蒋时红，吴耀松，刘燕，等.胃康舒宁促胃癌细胞凋亡机制与线粒体凋亡途径［J］.中国实验方剂学杂志，2013，21：203-206.
(收稿日期：2014.12.17)
