[关键词] 人乳头瘤病毒；杂交；感染；高危型
[中图分类号] R752 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）20-20-04
Genotyping and analysis of human papillomavirus infection in 4696 cases
HU Xinnian1 OU Wenyue2 LONG Hui1 OUYANG Hui1
1.Genetic Laboratory Diagnosis Center of Prenatal Maternal and Child Health Hospital of Qingyuan，Qingyuan 511500，China；2.People's Hospital of Qingyuan Guangdong，Qingyuan 511500，China
[Abstract] Objective To investigate the infection status and gene subtype distribution of HPV in 4696 cases of gynecological outpatients and physical examination centers in Qingyuan. Methods HPV DNA typing test was performed by using the HPV-DNA nucleic acid molecule fast hybridization method to detect the vaginal secretions of women. Results In 4，696 women，831 were positive， with a rate of 17.70%.In addition，there were 342 women infected with two or more subtypes，which mainly in high-risk HPV infection.HPV 52 and HPV 16，the most common subtypes，accounted for 25.5% and 13.5% respectively in these people.The rate of HPV infection in the high-risk group was 20.25%，higher than that in the physical examination group （12.63%）.There were no statistically significant differences in HPV infection rates among the various age groups（P>0.05）. Conclusion The infectious rate of female HPV in Qingyuan area was 17.7%，mainly in high-risk infection type.The most common infection subtype was HPV 52.
[Key words] HPV；Hybridization；Infection；High risk type
人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一种DNA病毒，属于乳头多瘤空泡病毒科（papovaviridae），乳头瘤病毒属，主要感染人类表皮和黏膜鳞状上皮等部位，HPV在不同部位引起的病变是不一的，如在表皮引起的增生性病变称为“疣”，感染黏膜鳞状上皮则主要引起增生[1-2]。宫颈癌是全世界发病率和死亡率较高的女性生殖道恶性肿瘤之一，并且每年的增长率达到2%～3%，在我国每年就有将近13.15万例新增患者，我国宫颈癌的发生占世界总新发生率的28%，且目前已有研究表明女性感染HPV与宫颈癌的发生存在一定关联[3-6]。
目前HPV已经确定的亚型有200多种，并根据其病变部位和致病力强弱分为低危型和高危型，两者都能够促进细胞的增殖，且在临床上对人体有增殖样损伤，但两者基因在人体内功能有着明显的差异，HPV低危型在感染过程中虽然有HPV病毒的释放，但是其病毒基因不会整合到宿主细胞DNA中，而HPV高危型能够将其DNA整合到宿主细胞内的DNA中，并且表达癌蛋白，进而整合到宿主周期蛋白中，从而抑制宿主抑癌基因的作用，从而导致细胞癌变。医院常见检测的低危型（非癌相关型）主要有1、2、3、4、7、10、27、40、42、43等，这些与寻常疣、扁平疣等相关，很少导致癌症[7]。高危型（癌相关型）又分为两种：（1）疣状表皮发育不良（EV）-HPV相关型：HPV 5、8、9、12、14、15、17、19～25等。（2）生殖道癌前病变/癌-HPV型：HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59等，这些高危型HPV的感染通常与恶性肿瘤密切相关，其中HPV 16和HPV18是与宫颈癌的发生密切相关[8-9]。高危型HPV持续性感染的发生是宫颈癌发生的必要因素，同时也和阴部肿瘤以及外生殖器相关的恶性肿瘤发生有一定关系[10]。为了解清远市妇女感染HPV的状况，不同年龄阶段的感染分布规律以及各常见HPV亚型感染分布状况，特地收集2016年来我院检查的4696位女性资料进行分析，受检女性来个不同区域、不同年龄以及不同职业，具有随机性，能够代表清远市妇女的健康状况。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2016年1～12月在我院妇科门诊和常规体检的4696例居住在清远不同地区的女性，对实验结果进行回顾性分析。入选标准：医生开出HPV DNA检测项目即作为研究对象，选取其宫颈刷片标本，年龄分布在16～64岁之间，所有研究对象均有性生活史、非月经期且检查前24h无性生活；排除标准：选取标本细胞较少、有子宫切除或者宫颈手术者。
资料整理：将2017年本实验室封存的检测膜条进行分类整理统计，分别按照感染的不同亚型（23种）、不同年龄（16～64岁）、就诊原因（妇科门诊和健康体检）以及感染种类（单种和多重感染）进行计数统计并结合t检验和χ2检验进行分析。
高危组和体检组的区分 高危组包括存在不规则阴道出血或者接触性阴道破损的妇女或者有其它不适症患者。体检组包括我院体检中心接待健康体检的清远常住妇女。
1.2 實验方法
1.2.1 标本采集 由妇科医生用亚能生物科技有限公司提供的专门采集宫颈脱落细胞采集器从患者体宫颈内进行采集。医生通过窥阴器或者阴道扩增器将女性宫颈暴露，然后用无菌棉签将分泌物擦拭干净，再用宫颈刷按照同一方向旋转4～5圈，然后放置专用保存管内并且折断保存送检。
1.2.2 检测试剂与仪器 深圳市亚能生物技术有限公司提供的人乳头瘤病毒23型检测试剂盒；由美国ABI公司生产的real-time PCR system进行扩增；全自动核酸分子杂交仪（YN-H18）进行杂交。
1.2.3 检测方法 检测方法：PCR-反向斑点杂交法：将送检标本用3mL吸管充分混匀，吸取1mL左右混匀液至1.5mL EP管内，在13 000rpm条件下离心10min去上清，加入100μL裂解液混匀，100℃条件下加热10min，13 000rpm离心10min，取5μL上清加入PCR试剂内，离心机内瞬离，然后进行PCR扩增，扩增完成然后在全自动杂交仪上杂交显色。
结果判读：该方法主要检测23种亚型，分别为：HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、81、82、83。每张膜条上均有质控IC点，只有IC点出现蓝点，才说明实验有效。哪个数字出现蓝色点就代表感染哪种亚型的HPV。
1.3 统计学处理
采用统计学软件spss18.0版对数据进行统计分析，计量资料采用（）表示，采用t检验，计数资料采用百分数表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同亚型HPV在感染妇女群体内的分布情况
2016年1～12月在我院就诊检查HPV患者共4 696例，其中检测出阳性的患者有831位，阳性率为17.70%。共检测到23种亚型，其中高危型18种，分别包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83，低危型5种，分别为6、11、42、43、81，其中HPV各高危型感染例数共有940例，低危型例数共有140例，其中包括双重感染者和多重感染者，应用t检验方法对两组数据进行分析，发现两组数据间差异有统计学意义（t=4.25，P<0.01），由此可见，清远地区妇女主要以HPV高危型感染为主。而在HPV高危型感染的患者中，又以HPV 16、52、58这三种高危亚型感染最为常见，分别占HPV总感染例数的13.5%、25.5%、12.8%。HPV低危型感染则以HPV 81最为常见，占HPV总感染数的7.4%，而在各低危型感染患者中所占的比例为57.1%。见表1。
2.2 高危组和体检组HPV基因亚型分布情况
来我院检测HPV的4696例妇女分别来自妇科门诊和体检中心的，其中门诊人数为3120例，常规体检的为1576例。妇科门诊的患者感染HPV例数为632例，检出率为20.25%。体检人员中共检测出199位HPV感染者，检出率为12.63%。通过χ2检验将两组数据比较分析，差异有统计学意义（χ2=10.253，P<0.05）。见表2。
2.3 HPV在不同年龄阶段检出率
来我院受检的4696例女性年龄分布于16～65岁之间，21～40岁年龄阶段检测者居多，占所有检测者的65.65%。其中26～30岁和31～35岁这两个年龄阶段感染率最高，分别为20.94%和18.92%。46岁以上的女性也是HPV感染高发人群，有786例女性受检，阳性率高达22.01%。但是各年龄阶段之间HPV感染率比较，差异无统计学意义（χ2=0.25，P>0.05）。见表3。
2.4 HPV多重感染在各年龄阶段的分布情况
通过临床检测发现，许多女性不是单纯感染单种亚型HPV，而是感染两种及两种以上，有324例感染2种亚型HPV，49例感染3种及以上。从数据中可以看出，低于20岁的HPV感染者中，多重感染患者占了74.19%。见表4。
3 讨论
宫颈癌是世界上死亡率高和较为常见的一种恶性肿瘤，而HPV的持续性感染是宫颈癌发生的重要原因之一，并且其主要发生在发展中国家[11]。有研究表明，在已发现的200多种HPV亚型中有30多种是与宫颈癌的发生有关，所以快速有效的HPV检测和分型，从而能够有效地治疗和关注，从而对HPV持续感染引起的宫颈癌的预防有着重要的作用[12-13]。
通过本调查研究发现，在清远地区妇女体内感染的HPV 亚型中，HPV 52（高危型）的感染率最高，占HPV总感染率的25.5%。目前已有研究表明在全世界宫颈癌患者体内HPV 52的检出率排在第七位，同时HPV 52也是导致亚洲宫颈癌的主要因素之一。其次是HPV 16和HPV 58，HPV 16的检出率为13.5%，它是所有亚型中研究最为清楚的，目前其流行特点和分子结构已经研究清楚，是宫颈癌和肛门生殖器肿瘤（如肛门癌、阴茎癌和外阴癌等）的必要致病因素，同时也有研究证明其与口咽癌以及头颈部肿瘤的发生存在相关性[14]。HPV 58是亚洲正常和非正常宫颈细胞的主要感染亚型之一，也是地区性宫颈癌发生的高危因素之一，在我院受检感染妇女体内的比率为12.8%。 通过表3调查分析发现，在清远地区各年龄组之间HPV的感染率无明显差异。可能原因是随着社会的发展，女性发生性行为的年龄降低，从而导致低年龄的感染患者增加，高年龄组随着年纪的增长，机体免疫力下降，许多患者可能是出现宫颈病变或者其它宫颈症状前来就诊，从而导致HPV的感染率升高[10]。
清远地区宫颈癌发生的高危人群较多，多重感染率较高，且不同年龄阶段均有分布。在研究数据中显示年龄小于20岁的HPV感染者中，多数感染两种及两种以上亚型，且为多种高危亚型联合感染。但目前有研究表明，HPV的多重感染仅仅能够增加宫颈的病变，与增加宫颈癌的发生率无直接密切的关系[12-15]。
从本文研究可以看出，清远市妇女主要以高危型HPV感染为主，尤其是HPV 52、HPV 16、HPV 58三種亚型。且各年龄阶段女性感染HPV的概率没有明显的区别，因此所有女性都是高危易感人群。目前世界上的疫苗只能针对16、18两种亚型，所以其他高危型也需要引起重视[11]。在生活中主要以预防为主，加大宣传力度，提升妇女对HPV的了解与认识，注意个人卫生，对青春期女性这一群体进行性知识教育，定期进行HPV和宫颈细胞学检测，从而降低女性宫颈癌发生的概率，做到早发现早治疗。
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