卓文基 钱明 陈涛 陈燕梅 江勇 郭卉欣 李海成 黄树智 钟球 周琳
【摘要】目的 探讨肺结核患者血清中巨噬细胞相关细胞因子IL?6、IL?12、IL?23、TNF?α、IFN?γ的变化及其临床意义。方法采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测30例活动性肺结核患者（患者）；30例结核分枝杆菌感染者（感染者）；30例健康人血清中的IL?6、IL?12、IL?23、TNF?α、IFN?γ分泌水平。结果IL?6在健康人、患者者和感染组血清中的分泌水平分别为：0.43±0.03 pg/ml， 0.86±0.04 pg/ml， 0.46±0.02 pg/ml；IL?12在健康人、患者者和感染组血清中水平分别为：9.43±0.22 pg/ml， 14.96±0.58 pg/ml， 9.58±0.20 pg/ml；IL?23在健康人、患者者和感染组血清中水平分别为： 269.58±28.58 pg/ml， 336.58±30.61 pg/ml； 332.03±25.71 pg/ml；IFN?γ在健康人、患者者和感染组血清中水平分别为： 90.80±2.05 pg/ml， 116.15±4.96 pg/ml，114.29±3.16 pg/ml；TNF?α在健康人、患者者和感染组血清中水平分别为： 13.87±3.28 pg/ml， 14.06±2.14 pg/ml，13.43±3.12 pg/ml。统计分析发现：IL?6、IL?12、IL?23、IFN?γ在患者血清中的分泌水平显著高于健康对照组（p<0.05）；IL?23与INF?γ在感染者血清中的分泌水平显著高于健康对照组（p<0.05）；IL?6与IL?12在患者血清中的分泌水平显著感染者组（p<0.05）；其余细胞因子在3类人群血清中分泌水平差别无统计学意义。结论血清中巨噬细胞相关细胞因子IL?6、IL?12、IL?23、IFN?γ在肺结核发病中具有重要意义，具有成为肺结核临床诊断依据可能。
【关键词】肺结核 巨噬细胞 细胞因子
【Abstract】ObjectiveTo explore the Clinical significance of detecting cytokines （IL-6、IL-12、IL-23、TNF-α、IFN-γ） secrete by macrophage in serum of patients. MethodELISA method was used to measure the level of five cytokines （IL-6， IL-12， IL-23， TNF-α， IFN-γ） expression of the different groups， including 30 cases of patients with active pulmonary tuberculosis， 30 cases of people with latent Mycobacterium Tuberculosis， 30 cases of healthy controls. ResultThe levels of IL-6 in healthy control， pulmonary tuberculosis group and latent Mycobacterium tuberculosis group respectively was 0.43±0.03 pg/ml， 0.86±0.04 pg/ml， 0.46±0.02 pg/ml； The levels of IL-12 in healthy control， pulmonary tuberculosis group and latent Mycobacterium tuberculosis group respectively was 9.43±0.22 pg/ml， 14.96±0.58 pg/ml， 9.58±0.20 pg/ml； The levels of IL-23 in healthy control， pulmonary tuberculosis group and latent Mycobacterium tuberculosis group respectively was 269.58±28.58 pg/ml， 336.58±30.61 pg/ml， 332.03±25.71 pg/ml； The levels of IFN-γ in healthy control， pulmonary tuberculosis group and latent Mycobacterium tuberculosis group respectively was 90.80±2.05 pg/ml， 116.15±4.96 pg/ml， 114.29±3.16 pg/ml； The levels of TNF-α in healthy control， pulmonary tuberculosis group and latent Mycobacterium tuberculosis group respectively was 13.87±3.28 pg/ml， 14.06±2.14 pg/ml， 13.43±3.12 pg/ml. Statistical analysis found that Levels of IL-6、IL-12、IL-23 and IFN-γ in pulmonary tuberculosis group were significantly higher than those in healthy control group （p<0.05）， IL-23、IFN-γ in latent Mycobacterium tuberculosis group were significantly higher than those in healthy control group. Compared with the latent Mycobacterium Tuberculosis group， the levels of serum IL-6、IL-12 in the active pulmonary tuberculosis group were significantly higher （p<0.05）. The other cytokines levels in active pulmonary tuberculosis group， latent Mycobacterium Tuberculosis group and the healthy control group had not significantly different．ConclusionCytokines （IL-6、IL-12、IL-23 and INF-γ） secrete by macrophage in serum play an important role in the immune pathogenesis of pulmonary tuberculosis. It is suggested that those cytokines may have potential for clinical diagnosis.
【Key words】 Tuberculosis， cytokines， macrophages
【Author′s address】Tuberculosis Control Center of Guangdong Province， Guangzhou ，510630，PRC
doi：10.3969/j.issn.1671-332X.2014.10.002
结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病。可以在人身体的多处器官发病，以肺部发病最为常见，称肺结核［1］。在全世界范围内，结核病仍旧是影响公众健康的致死性疾病之一，每年因结核病死亡的患者达130万例。在我国结核病感染人数居世界第一，结核病患者数量仅次于印度，居世界第二［2-3］。细胞因子（cytokine）是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能［4］。近年来，关于细胞因子在结核病发病机制中的研究逐渐增多［4-6］。巨噬细胞是结核分枝杆菌寄生的场所，也是自然免疫中抗结核分枝杆菌感染重要的免疫细胞。活化后的巨噬细胞自身以及分泌的相关细胞因子参与限制结核分枝杆菌的生长杀灭结核分枝杆菌的过程，在抵御结核分枝杆菌感染过程起着至关重要的作用［7-8］。因此，本研究采用ELISA法检测不同人群血清中的巨噬细胞相关细胞因子水平，对深入探索肺结核免疫机制和临床诊断具有重要意义。
1材料和方法
1.1样本纳入选取广东省结核病生物样本库中血清样本，包括临床确诊的活动性肺结核患者30例，男女各15例，平均年龄（35.5±15.3）岁。结核分枝杆菌感染者即PPD阳性，但未出现明显症状的人群30例，男女各15例，平均年龄（39.0±17.2）岁；未感染结核分枝杆菌即PPD阴性健康人30例，男女各15例，平均年龄（28.3±16.9）岁。
1.2主要试剂与耗材人IL?6、IL?12、IL?23、TNF?α、IFN?γ 细胞因子ELISA检测试剂盒购自于美国RD公司；各种规格的移液枪吸头购自AXYGEN公司。
1.3检测方法Elisa检测操作方法：①按试剂盒说明书准备所需的试剂和标准品；②从已平衡至室温的密封袋中取出微孔板，分别将不同浓度标准品，质控品，实验样本加入相应孔中，每孔100 uL。用封板胶纸封住反应空，室温孵育2小时；③将板内液体吸去，使用自动洗板机洗板，每孔加洗涤液300 uL，重复4次，最后一次洗板结束，将板将板倒置，在吸水纸上拍干所有残留液体； ④在每个微孔内加入200 uL酶标检测抗体，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时；⑤重复第3步洗板操作；⑥在每个微孔内加入200 uL显色底物，室温避光孵育30分钟；⑦在每个微孔内加入50 uL终止液，加入终止液后30分钟内，使用酶标仪测量450 nm的吸光度值。
1.4统计学分析采用spss 16.0软件中One Way ANOVA对数据进行统计分析，p>0.05为差异不显著，p<0.05为差异显著。
2结果
2.15种细胞因子在3组不同类型人群血清中的分泌水平
IL?6在健康人、患者者和感染组血清中的分泌水平分别为：0.43±0.03 pg/ml， 0.86±0.04 pg/ml， 0.46±0.02 pg/ml；IL?12在健康人、患者者和感染组血清中水平分别为：9.43±0.22 pg/ml， 14.96±0.58 pg/ml， 9.58±0.20 pg/ml；IL?23在健康人、患者者和感染组血清中水平分别为： 269.58±28.58 pg/ml， 336.58±30.61 pg/ml； 332.03±25.71 pg/ml；IFN?γ在健康人、患者者和感染组血清中水平分别为： 90.80±2.05 pg/ml， 116.15±4.96 pg/ml，114.29±3.16 pg/ml；TNF?α在健康人、患者者和感染组血清中水平分别为： 13.87±3.28 pg/ml， 14.06±2.14 pg/ml，13.43±3.12 pg/ml。见表1。
2.25种细胞因子在3组不同类型人群血清中的分泌水平比较分析
IL?6（p=0.03）、IL?12（p=0.01）、IL?23（p=0.02）、IFN?γ（p=0.01）在患者组血清中的分泌水平显著高于健康人组；IL?23（p=0.01）与INF?γ（p=0.01）在感染者组血清中的分泌水平显著高于健康人组；IL?6（p=0.02）与IL?12（p=0.01）在患者组血清中的分泌水平显著感染组；其余细胞因子浓度在3组不同类型人群血清中分泌水平差别无统计学意义（p>0.05），且TNF?α分泌水平在3组人群血清中差别均无统计学意义（p>0.05）。
3讨论
结核病是危害公众健康的慢性传染性疾病之一，我国的结核病控制形式十分严峻［9-10］。结核病的发生是一个较为复杂的过程，其与结核分枝杆菌致病力的大小有一定的相关性［11］。同时机体自身免疫力的强弱以及免疫细胞分泌细胞因子的动态平衡也均在抗结核免疫应答及免疫调节中起着重要的作用。经研究发现巨噬细胞是宿主抵御结核分枝杆菌感染播散的重要防御屏障，它可以通过复杂的网络系统清除结核分枝杆菌，如TNF?α和细胞因子的产生，巨噬细胞的凋亡或清除已胞吞细菌的宿主巨噬细胞等［12］。本研究选择IL?6、IL?12、IL?23、TNF?α、IFN?γ5种巨噬细胞相关细胞因子为切入点，来分析结核病免疫应答中细胞因子的分泌及其可能存在的临床意义。
细胞因子如IL?6、IL?12、TNF?α等在机体保持细胞免疫和免疫记忆中具有重要的作用。TNF?α可以显著地诱导巨噬细胞抑制结核分枝杆菌生长，引起机体产生有效的肉芽肿免疫应答［13］。结核分枝杆菌感染宿主后，IL?12能够增强Th1型细胞免疫，提高天然免疫和特异性免疫之间的联系，在抵御结核分枝杆菌感染免疫中起着较为重要的作用［14］。此外IL?6、IL?12、IFN?γ、TNF?α属于促炎症细胞因子，TNF?α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放［15-16］。IL?6能诱导B细胞分化和产生抗体，并诱导T细胞活化增殖、分化，参与机体的免疫应答，是炎性反应的促发剂［17］。IFN?γ对体液免疫、细胞免疫均有免疫调节作用，对巨噬细胞及NK细胞也有一定的免疫增强作用［18］。最新研究发现IL?23在机体控制感染和自身免疫反应中起重要作用，但其具体作用机制仍存在争议。有文献报告，IL?23的免疫调节作用可能与其增强一类不同于Th1和Th2的细胞亚群Th17型反应有关，它可促进Th17细胞扩增和存活，并分泌具有强大的募集和激活嗜中性粒细胞功能的IL?17，从而发挥其免疫学效应，在自身免疫性疾病和变应性疾病发病中发挥作用［19］。
本研究采用ELISA方法对巨噬细胞相关的5种细胞因子进行了检测，为深入了解肺结核发病的细胞因子网络的动态变化，为肺结核的病情进展检测以及免疫治疗等提供实验依据。研究结果发现在活动性肺结核患者血清中IL?6分泌水平显著高于结核分枝杆菌感染组，这与Verbon等研究相符［20］。IL?6分泌水平升高可能由于Toll样受体通过与细菌LPS相互作用介导的调控引起巨噬细胞分泌大量的IL?12和TNF?α而出现的负反馈调节机制［13］。IL?23在活动性肺结核组与结核分枝杆菌感染组血清中的分泌水平都高于健康对照组，可能与其在机体控制感染和自身免疫反应作用相关，肺结核是一种慢性疾病，在其整个免疫过程中均存在感染和自身免疫反应。在肺结核的疾病进程中，T细胞是重要的免疫效应细胞，IL?12在患者血清中大量存在，与其能够引起T细胞免疫反应和促进TH1细胞的增生存在一定的关系［14］。TNF?α在免疫进程中既可以至炎也可抗炎，在机体抗感染过程中有一定的保护作用，但当分泌过多时也可以引起病情恶化［15］，本研究发现，TNF?α在3类人群血清中表达的水平近似，这可能与IL?6和抗炎因子IL?10抑制巨噬细胞产生TNF?α，存在一定的相关性，说明肺结核患者的免疫功能以保护性免疫机制为主。
本研究采用ELISA方法对血清中的细胞因子浓度进行检测，此方法的重复性和准确性略低，在后续研究中可采用细胞因子蛋白芯片方法进行进一步验证。此外本研究的样本的纳入量每组为30例，可能会对结果产生一定的影响，在后续的验证中将加大样本量来进一步统计分析。
综上所述，检测体内细胞因子的分泌水平可以为深入了解肺结核的发病机制和活动进程，有助于判断疾病进程，预后以及治疗效果。此外，通过分析细胞因子在血清中分泌水平差别，有可能成为肺结核临床诊断依据。
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