杜 军，邓光存
（宁夏大学生命科学学院，银川 750021）
摘要：以牛结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis，MTB）C68001株基因组DNA为模板，克隆免疫优势抗原基因Ag85B，构建重组表达质粒pET－28a－ag85b，转化入大肠埃希菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达重组蛋白，对表达产物进行SDS－PAGE和Western blot分析。以明胶为佐剂，Ag85B为目的抗原制备纳米疫苗，并对其进行了相关的工艺检测。以BCA法建立测定蛋白质含量的标准曲线，在此基础上检测纳米疫苗的载药率和包封率。结果显示，明胶佐剂疫苗的载药率为71．83％，包封率为41．03％，符合纳米疫苗的工艺要求。
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关键词 ：牛结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis，MTB）；Ag85B抗原；原核表达；纳米疫苗
中图分类号：R392．11 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）06－1421-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.035
Expression of Mycobacterium Bovis Antigen Protein Ag85B and Preparation
of Its Nano－vaccine
DU Jun， DENG Guang－cun
（College of Life science， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）
Abstract： The immuno－dominant antigen gene Ag85B was cloned using the genomic DNA of Mycobacterium bovis strain C68001 as template and used to construct the recombinant plasmid pET－28a－ag85b， transformed into E． coli BL21（DE3）． Induced by IPTG， the expressed recombinant protein was analyzed by SDS－PAGE and Western blot method． The nano－vaccine was prepared using gelatin as adjuvant and Ag85B as objective antigen. The related technology was tested． Based on the protein standard curve obtained with BCA method. The drug loading and encapsulation efficiency of the nano－vaccine was 71．83％ and 41．03％， respectively， metting the technological requirements of nano－vaccine．
Key words： Mycobacterium bovis（MTB）， Ag85B antigen， prokaryotic expression， Nano－vaccine
收稿日期：201－12－29
基金项目：宁夏自然科学基金项目（NZ13036）
作者简介：杜 军（1978－），男，宁夏惠农人，副教授，硕士，主要从事微生物与基因工程研究，（电话）13709599023（电子信箱）dujun@nxu．edu．cn。
牛结核病是由牛结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis，MTB）引起的一种牛的慢性消耗性传染病，该病可通过病畜传染给人类或其他动物，严重影响畜牧业的可持续健康发展，并威胁人类的健康［1，2］。据2009年世界卫生组织（WHO）的调查报告显示，全球每年新发结核病病例为800万～1 000万，有近300万的患者死亡［3，4］。目前，中国是世界上结核病负担最重的22个国家之一，是除印度之外的世界第二大结核病危害的重灾区［5］。世界卫生组织专家早就指出，除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的。可见，结核病不仅严重影响畜牧业的健康稳定发展，造成了巨额的经济损失，也严重危害着人类的健康。因此，为了控制牛结核病的传播流行，亟待开发牛结核病的新型诊断试剂和预防制剂。卡介苗（BCG）是目前公认的预防结核病的惟一疫苗，但由于它的免疫保护效力不稳定，对人群的保护率介于0～80％之间［6］。而对于牛来讲，接种BCG后，会干扰牛结核菌素（PPD）的检测结果，导致不能区别人工免疫和自然感染，从而影响牛的检疫和国际贸易。因此，为控制牛结核病的传播流行，研制开发一种有效且高效的牛结核病新型疫苗迫在眉睫。
目前，亚单位疫苗虽然有副作用较小、可以明确组成成分等优点，但其成本较高，而且加强免疫需要佐剂的辅助。重组BCG疫苗有生长缓慢、培养要求高、转化率较低等缺点。应用于DNA疫苗的载体有痘病毒载体和腺病毒载体，这些载体均属于病毒类载体，虽然可有效地将外源基因转入宿主细胞，但仍然存在着潜在的安全问题。以病毒作为载体具有不可控制的细胞毒性、对于刺激所产生的免疫反应的不可控以及缺乏区分感染细胞的能力等缺点，从而难于生产和包装［7－9］。
由于纳米粒子具有尺寸效应、表面效应、靶向作用和释缓药物、延长药物作用时间等优点，利于刺激机体产生细胞免疫反应［10］。因而，纳米疫苗的研制已成为生物技术领域的前沿和热点之一［11，12］。
本试验以明胶为载体材料，以卡波姆和Tween－80等为佐剂或表面活性剂，制备了载牛结核分枝杆菌免疫优势抗原蛋白Ag85B的纳米疫苗，并对其进行了相关的工艺检测，旨在为下一步研究其免疫原性奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株与载体 牛结核分枝杆菌C68001株基因组DNA、BL21（DE3）菌株、质粒载体pET－28a（＋）由西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室保存。
1．1．2 试剂与仪器 SpectraTM Multicolor Low Range Protein Ladder购于Thermo公司；Western BrightTM ECL购于环亚生物科技有限公司；Anti－His标签小鼠单克隆抗体、HRP－羊抗鼠IgG（H＋L）、Protein Pure Ni－NTA Resin购于北京全式金生物技术有限公司；IPTG购自陕西省西安化玻站化学厂；丙烯酰胺、N，N′－甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺购自华美生物工程有限公司；β－巯基乙醇、溶菌酶、考马斯亮蓝R250购自北京北方同正生物技术发展有限公司；TEMED购自Promega公司；明胶、大豆油购于新泰裕兴生物科技有限公司；Tween－80、卡波姆购自SIGMA－ALDRICH公司；Ag85B特异性抗体购自Abcam公司；HRP－羊抗鼠IgG；凯基BCA蛋白检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。
高速冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；UV－4802型紫外可见分光光度计，UNIC公司；超声破碎仪，UIBRA－CELL公司；Hitachi－7650B型电子透射显微镜（宁夏医科大学）。
1．2 方法
1．2．1 重组质粒pET－28a－ag85b的构建 根据文献［13］的方法和操作步骤构建重组质粒pET－28a－ag85b并对其进行鉴定。
1．2．2 重组质粒pET－28a－ag85b诱导表达 将阳性重组菌株接种于10 mL含有30 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD600 nm值为0．5～0．7时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，37 ℃诱导表达4～5 h，收集菌体。以同样的方法诱导空载体pET－28a作为对照。
1．2．3 Ag85B重组蛋白SDS－PAGE 和Western blot分析 以pET－28a（＋）空载体的转化菌为空白对照，收集诱导表达过程中的各个样品，在之后的冰浴超声破碎离心后，分别收集上清液和包涵体沉淀，上样于18％聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS－PAGE分析，以确定重组蛋白Ag85B 是否正确表达。电泳结束后用半干电转法将凝胶上的蛋白转到硝酸纤维素膜上，经5％脱脂奶粉封闭1 h，洗涤后再与1∶1 000稀释的特异性抗体在4 ℃条件下孵育过夜，洗涤后再与1∶6 000稀释的HRP－羊抗兔IgG在37 ℃条件下孵育1 h，充分洗涤后，用Western BrightTM ECL试剂盒化学发光曝光显影。
1．2．4 Ag85B重组蛋白的纯化
1）将过滤的镍柱用Lysis buffer进行平衡，之后加入Ag85B蛋白菌液，室温下颠倒混匀2 h，混匀后静置。
2）加入Wash buffer，所滴下的溶液-20 ℃保存备用。
3）重复步骤2。
4）加入Elution buffer，所滴下的溶液-20 ℃保存备用。Elution buffer根据其所含有的咪唑含量的不同分为3种溶液：即Elution buffer （250 mmol/L咪唑）、Elution buffer （500 mmol/L咪唑）、 Elution buffer （1 mol/L咪唑）。
5）将所收集的样品进行Western blot分析。
1．2．5 纳米粒疫苗的制备 根据文献资料总结，本试验采用的制备配方为明胶复合佐剂，制备步骤如下［14］：
1）将0．5 mL Tween－80加入6 mL大豆油中搅拌混匀，设为A液。
2）将目的抗原蛋白加入4 mL去离子水中进行混合，之后加入0．35 g卡波姆，1．5 g明胶，搅拌混匀，设为B液。
3）将A液缓缓加入B液中，慢慢滴加，边滴加边搅拌，形成的乳液在水浴中超声处理10～20 min。待明胶乳滴完全胶凝后，再用丙酮稀释，用220 nm孔径的滤膜进行过滤，将过滤后的滤液保存于4 ℃备用。
1．2．6 蛋白质含量标准曲线的建立 采用BCA法检测蛋白质含量，按试剂盒说明书步骤进行操作，并绘制蛋白质含量标准曲线。
1．2．7 载药率和包封率的测定 将所制备的纳米疫苗溶液用PBS缓冲液进行透析处理，分别换液3次，第一次和第二次换缓冲液的时间间隔8 h，最后一次换缓冲液的时间间隔24 h。取已制备好的纳米疫苗悬浮液1 mL，用1％ HCI破坏微球，蒸馏水稀释并定容至15 mL，之后调节pH至中性，按“1．2．6”的方法测定其OD540 nm值，换算得到载药纳米微囊中目的蛋白Ag85B的含量。计算纳米粒的包封率和载药率。计算公式如下：
包封率＝纳米粒中抗原含量/抗原投入量×100％
载药率＝（溶液中总抗原量-游离抗原量）/总抗原量×100％
1．2．8 稳定性的检测 将制备好的纳米疫苗置4 ℃保存3个月，观察有无凝结、沉淀。
1．2．9 纳米疫苗的表征检测 取一定量的纳米疫苗悬浮液，加入0．9％ NaCl溶液分散稀释40倍。滴至铺有碳膜的铜网上，滤纸吸干，自然晾干后在透射电子显微镜下观察纳米粒的表面形态，测量粒径。
2 结果与分析
2．1 Ag85B重组蛋白Western blot分析结果
以pET－28a（＋）空载体的转化菌为空白对照，收集诱导表达过程中的各个样品，以特异性抗体，HRP－羊抗兔IgG为二抗，进行Western blot分析。结果（图1）表明，诱导后的菌株、诱导后分离出的可溶性蛋白和包涵体蛋白均在33 ku左右出现了特异性阳性条带，对照组空载体pET－28a在相同位置无相应条带，表明表达的重组蛋白Ag85B能与抗体发生特异性结合，说明其具有良好的免疫原性。
2．2 Ag85B重组蛋白纯化结果
由于重组蛋白Ag85B携带His标签，通过与镍柱相结合，用含有的咪唑含量不同的3种洗脱液溶液（250 mmol/L咪唑、500 mmol/L咪唑、1 mol/L咪唑）分别进行洗脱，进而对洗脱液的浓度筛选出最适的条件，并对每一次所滴下的样品进行Western blot分析。结果（图2）表明，诱导后分离出的可溶性蛋白、过柱后的菌液、洗脱液（250 mmol/L咪唑）洗脱下的样品和洗脱液（500 mmol/L咪唑）洗脱下的样品均在33 ku左右出现了特异性阳性条带，而洗液后所收集的样品和洗脱液（1 mol/L咪唑）洗脱下的样品在相同位置无相应条带。综合分析后认为洗脱液（250 mmol/L咪唑）为最适合的浓度，所洗脱下的重组蛋白Ag85B的表达量明显高于诱导后分离出的可溶性蛋白。
2．3 纳米粒的载药率及包封率
2．3．1 蛋白质含量标准曲线的建立 按照“1．2．6”的方法，建立蛋白质含量标准曲线。测得的OD540 nm值如表1所示。以OD540 nm值与对应的蛋白质浓度关系线性拟合，得到标准曲线方程为：y＝0．011 8 x＋ 0．146 4（R2＝0．983 3）。结果表明在1～20 μg/μL浓度范围内，蛋白质浓度与OD540 nm值之间有良好的线性关系（图3）。
2．3．2 载药率和包封率的测定结果 初始抗原投入量为200 mg，按照“1．2．7”的方法和公式测定载药率和包封率，结果见表2。载药率是衡量载体效率的重要指标，由文献结果显示，药物载体的载药率一般为60％～85％，包封率一般为17．64％～56．84％［14］。由表2可见，所制备的明胶佐剂的纳米疫苗载药率和包封率的结果与文献相一致。
2．4 纳米疫苗稳定性检测结果
将所制备的纳米疫苗在4 ℃静置6个月，明胶纳米疫苗为乳白色悬乳液，外观无变化，无沉淀析出，表明其稳定性好。
2．5 纳米疫苗颗粒的表征
透射电子显微镜下观察明胶复合佐剂纳米疫苗的表面形态，由图4可见，所制备的明胶复合佐剂纳米疫苗颗粒粒径均一，平均粒径在100 nm左右。
3 小结与讨论
目前，国内外研究较多的结核分枝杆菌免疫优势抗原蛋白主要有Ag85B复合物、CFP10、ESAT－6和MPB64等。研究发现，在牛分枝杆菌、结核分枝杆菌和BCG培养液中Ag85B含量丰富［15］。Ag85复合物参与菌体细胞壁的合成，对维持菌体的结构起着重要作用［16］。研究表明，Ag85A和Ag85B可诱导特异性Th1型细胞免疫应答、诱导IFN－γ的产生及CTL反应［17］。Horwitz等［18］研究表明，重组Ag85A或者重组Ag85B免疫豚鼠后，可有效地诱导CD8＋T细胞免疫应答。研究发现Ag85B刺激健康人体后，外周血单个核细胞（Perpheral blood mononuclear cell， PBMC）有明显增殖并提高分泌IFN－γ［19］。因此，Ag85B是开发新型抗结核药物作用的靶位点［20，21］，也是开发新型疫苗的候选抗原。
本研究以明胶为载体材料，辅以卡波姆、Tween－80等佐剂或表面活性剂，采用纳米技术制备了明胶佐剂配方的载牛结核分枝杆菌免疫优势抗原蛋白Ag85B的纳米疫苗，对其进行了相关的工艺检测。结果显示，所制备的明胶纳米疫苗为乳白色悬乳液，稳定性好，4 ℃保存6个月外观无变化，无沉淀析出。在疫苗中的颗粒通过透射电镜观察形态，并测量了粒径。结果表明，疫苗颗粒粒径均一，平均粒径在100 nm左右，载药率为71．83％，包封率为41．03％，为下一步研究制备成功的纳米疫苗免疫原性的相关研究奠定了坚实的基础。
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