梁 琍，邱 岚，张 良
（铜仁学院生物与化学工程系／梵净山野生动植物资源保护与利用研究中心／梵净山特色动植物资源重点实验室，贵州 铜仁 ５５４３００）
摘要：通过响应面分析法对超声波提取梵净山野生藤茶（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）二氢杨酶素的工艺条件进行优化。以乙醇体积分数、料液比、提取时间为影响因素，在单因素试验的基础上，采用３因素３水平响应面分析法，根据Ｂｏｘ－Ｂｅｎｈｎｋｅｎ中心组合试验设计原理，以二氢杨酶素提取率为响应值，进行响应面分析，优化超声提取梵净山野生藤茶中二氢杨梅素的条件。结果表明，超声波提取藤茶中二氢杨梅素最佳工艺条件为乙醇体积分数５１．００％、料液比１∶２６．００（ｇ∶ｍＬ）、超声波时间４０．００ ｍｉｎ，在此条件下二氢杨梅素的提取率为２８．４１％，回归模型预测的二氢杨梅素提取率为２８．６１％，经验证ＲＳＤ为１．１６％，拟合度较好，说明响应面法优化超声提取藤茶二氢杨梅素的工艺条件稳定可行。
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关键词 ：藤茶（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）；二氢杨梅素；超声波提取；响应面分析法
中图分类号：Ｓ５６７．５＋３；Ｒ２８４．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０２－０416－０5
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０２．０40
藤茶属葡萄科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）蛇葡萄属（Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ），学名为显齿蛇葡萄 （Ａｍｐｅｌｏｐｓｉｓ ｇｒｏｓｓｅｄｅｎｔａｔａ）， 俗称甜树茶、甜茶藤等，是一种多年生的藤本植物，生长在海拔４００～１ ３００ ｍ的山坡、林中、河滩等阴湿和肥沃的土壤中，是一种典型的药食两用植物［１］。藤茶中含有多种化学成分，包括水分、蛋白质、维生素、多酚和黄酮等，其中黄酮类化合物具有最重要的药理作用，而二氢杨梅素是其中最重要的黄酮类化合物，藤茶系目前国内外发现的二氢黄酮类化合物中含量最高的植物［２］，经试验证明，二氢杨梅素具有抗氧化、镇痛、止咳、广普抑菌、保肝护肝、降血糖、降血脂、增强人体免疫力以及抑制肿瘤等多种功效［３］，具有很高的应用价值。
梵净山位于贵州省东北部江口、印江和松桃３县交界之处，总面积５６７ ｋｍ２，主峰凤凰山海拔２ ５７２ ｍ，是武陵山系最高的山体，是一个以珍稀植物和动物为主的国家级自然保护区。１９８６年被联合国教科文组织批准接纳为世界“人与生物圈”保护区网的成员［４］。该保护区植被类型多样，主要有针叶林、阔叶林、竹林、灌丛、沼泽５个类型［５］，植物资源极为丰富，达１ ８００种［４］，是非常宝贵的药用植物资源库。目前关于梵净山野生藤茶二氢杨梅素的提取尚未见报道。
本研究以梵净山野生藤茶为原料，在超声波辅助提取藤茶中二氢杨梅素的基础上，采用Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面法对提取条件进行优化，为开发梵净山野生藤茶及其综合利用提供依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料与仪器
试验所用藤茶采自梵净山，将藤茶在６０ ℃下烘干，经高速万能粉碎机粉碎，过４０目筛，将其装于干燥试剂瓶，贴上标签作为待测样品。
主要试剂：二氢杨梅素标准品（纯度＞９８％，上海融禾医药科技有限公司）；９５％乙醇［分析纯，重庆川东化工（集团）有限公司］；无水三氯化铝（天津市博迪化工有限公司）等。
主要仪器：ＧＵＴＥＬ超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；１０１－３型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；ＦＷ８０型高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）；ＫＱ－Ｃ型玻璃仪器气流烘干器（巩义市予华有限责任公司）；电子分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；ＳＨＺ－ＤＩＩＩ予华牌循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；Ｔ６型新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）等。
１．２ 试验方法
１．２．１ 标准曲线的绘制 准确称取二氢杨梅素标准品５．２ ｍｇ，用９５％的乙醇定容到５０ ｍＬ容量瓶中揺均，分别吸取溶液０、０．２５、０．５0、０．７５、１．００、１．２５ ｍＬ置１０ ｍＬ容量瓶中，精确加入质量分数为５％的ＡｌＣｌ３溶液３ ｍＬ，用９５％的乙醇溶液定容到１０ ｍＬ，揺均后放置４０ ｍｉｎ，在３１５ ｎｍ的波长下测定吸光度［６］，以标准溶液的含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线（图１），得到的回归方程为：Ａ＝７８．６８６ｘ＋０．００６ ７，Ｒ２＝０．９９８ ９（ｎ＝５）。
１．２．２ 藤茶中二氢杨梅素含量的测定 准确称取１ ｇ藤茶粉末放入锥形瓶中，按１∶２０（ｇ∶ｍＬ，下同）的料液比加入５０％的乙醇浸泡１０ ｍｉｎ，放入超声波功率８０ Ｗ处理４０ ｍｉｎ吸取提取液抽滤。将趁热抽滤的提取液装于大试管中，抽取０．１ ｍＬ于１０ ｍＬ的容量瓶中，用９５％的乙醇定容至刻度摇匀，抽取１ ｍＬ于另外的１０ ｍＬ容量瓶中，加入５％的ＡｌＣｌ３ ３ ｍＬ，用９５％的乙醇定容至刻度揺匀，同时做空白液对照，在室温下放置４０ ｍｉｎ，于分光光度计中测定吸光度［７］，其提取率的计算公式为：
二氢杨梅素的提取率＝（Ａ－０．００６ ７）×Ｖ×Ｐ×Ｋ／１ ０００×Ｇ×７８．６８６×１００％
式中，Ａ为提取液的吸光度；Ｖ为提取液的体积（ｍＬ）；Ｐ为稀释倍数（Ｐ＝１ ０００倍）；Ｇ为藤茶的质量（ｇ）；Ｋ为二氢杨梅素在总黄酮中的质量分数（Ｋ＝０．８６）［８］。
１．２．３ 单因素试验 设置单因素试验分别考察超声波提取二氢杨梅素时乙醇体积分数、料液比、提取时间对二氢杨梅素提取率的影响。①乙醇体积分数。室温（２０ ℃）下放置１０ ｍｉｎ、料液比１∶２０、超声时间４０ ｍｉｎ、超声波功率８０ Ｗ，乙醇体积分数分别取３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％。②料液比。室温（２０ ℃）下放置１０ ｍｉｎ、超声波时间４０ ｍｉｎ、超声波功率８０ Ｗ，料液比分别取１∶１０、１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０、１∶３５。③提取时间。室温（２０ ℃）下放置１０ ｍｉｎ、乙醇体积分数５０％、超声波功率８０ Ｗ，提取时间分别为２０、３０、４０、５０、６０、７０ ｍｉｎ。
１．２．４ 响应面优化试验设计 根据Ｂｏｘ－Ｂｅnｈｎｋｅｎ中心组合试验设计原理，结合单因素试验结果，利用Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ．Ｖ８．０软件设计响应面试验，选取乙醇体积分数（Ａ）、超声波时间（Ｂ）、料液比（Ｃ）为自变量，二氢杨梅素提取率（Ｙ）为响应值［９－１２］，做３因素３水平共１７个试验点的二次回归正交组合设计试验。利用Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２００７、Ｏｒｉｇｉｎｐｒｏ７．５、Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ．Ｖ８．０软件来进行数据处理和分析。
２ 结果与分析
２．１ 单因素试验结果
２．１．１ 乙醇体积分数对二氢杨梅素提取率的影响 由图２可知，随着乙醇体积分数的增加，提取率逐渐增加。当乙醇体积分数为５０％的时候提取率达到最大，继续增加乙醇体积分数，二氢杨梅素的提取率又呈下降趋势，出现这种情况的原因是因为二氢杨梅素为极性化合物，根据相似相容的原理，当溶剂体系的极性与二氢杨梅素的极性相当时，二氢杨梅素的提取率达到最佳。从图２中可以看出，乙醇体积分数为５０％时，溶剂体系的极性与二氢杨梅素的极性相当，所以这时候的提取率达到最大，因此，乙醇体积分数为５０％时最佳。
２．１．２ 提取时间对二氢杨梅素提取率的影响 由图３可以看出，由于二氢杨梅素热稳定性相对较好，在较短的时间内，其结构不会发生太大的变化，在其他条件恒定时，二氢杨梅素的一般提取率的超声波提取时间为２０～５０ ｍｉｎ，随着时间的延长提取率呈现先增后降的趋势，当超声波提取时间为４０ ｍｉｎ时，二氢杨梅素的提取率达到最大，因此４０ ｍｉｎ为最佳的提取时间。
２．１．３ 料液比对二氢杨梅素提取率的影响 一般情况下，随着溶剂的增加，可以使细胞壁内外浓度差增大，有利于有效成分的溶出，提取效果就越好。从图４可以看出，料液比在１∶１０～１∶２５之间时，随着溶剂的增加，二氢杨梅素提取率逐渐增大，在１∶２５时达到最大，之后随着溶剂的增加，二氢杨梅素的提取率反而缓慢的下降，因此确定料液比为１∶２５最为合适。
２．２ 响应面试验结果
根据单因素试验结果确定响应面各因素及水平如表１所示。采用Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ软件，选用Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ模型，以野生藤茶中二氢杨梅素提取率为响应值，设计３因素3水平共１７个试验点的响应面试验，试验结果如表２所示。通过Ｄｅｓｉｇｎ－ｅｘｐｅｒｔ．Ｖ８．０软件对响应面试验结果进行回归分析，以Ａ、Ｂ、Ｃ为自变量对提取率Ｙ进行数据拟合建立如下多元二次回归数学模型：Ｙ＝２８．１７＋１．７２Ａ＋１．０８Ｂ＋１．７９Ｃ－０．０９５ＡＢ＋０．２４ＡＣ－１．３６ＢＣ－６．１４Ａ２－３．４４Ｂ２－２．８７Ｃ２为了检验方程的有效性，对藤茶中二氢杨梅素提取的数学模型进行了方差分析，结果见表３。由表３可知，此模型Ｆ值为２８．９３，Ｐ＝０．０００ １，该模型极显著，失拟项不显著（Ｐ＝０．０８４ ９＞０．０５），说明建立的模型与实际有较好的拟合度。该方程的回归决定系数为０．９７３ ８，说明有９７．３８％的响应值符合此模型，校正决定系数为０．９４０ ２，说明有９４．０２％的试验数据可用此回归模型来解释，其中变异系数为５．０８％、精密度为１４．３６５%，说明此方程具有良好的稳定性和精密度［１３］。综上所述，该模型能较好地拟合实际超声波提取藤茶中的二氢杨梅素。
为了更直观地表现两个因素同时对藤茶中二氢杨梅素提取率的影响，通过Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ．Ｖ８．０对试验因素Ａ、Ｂ、Ｃ以任意一项为固定值对其余两项进行响应面分析和作图［１４］，以考察各交互项对藤茶中二氢杨梅素提取率的的影响，结果见图５、图６和图７。
由图５（ａ）可知，当料液比确定为最佳值１∶２５时、乙醇体积分数不变，可知提取时间响应面曲线图比较平缓，在料液比为１∶２５、提取时间不变时，随乙醇体积分数的增加，提取率先增大后减小，说明在此条件下乙醇体积分数对响应值的影响比较大。从图５（ｂ）可知，提取时间和乙醇体积分数的等高线呈圆形，说明提取时间和乙醇体积分数对超声波提取藤茶中二氢杨梅的交互作用不显著。
由图６（ａ）可知，当乙醇体积分数确定为最佳值５０％时，提取时间不变，随着料液比的增加，提取率先增大后缓慢降低，当料液比不变时，随提取时间的延长，提取率也缓慢降低，说明在此条件下提取时间和料液比响应面曲线呈先增大后减小的趋势，说明两者增加对二氢杨梅素的提取率影响效果明显。从图６（ｂ）可知，提取时间和料液比的等高线图呈椭圆形，说明提取时间和料液比对超声波提取藤茶中二氢杨梅素的交互作用显著。
由图７（ａ）可知，当提取时间确定为最佳值４０ ｍｉｎ时，乙醇体积分数不变时，料液比响应面比较平缓，说明在此条件下料液比对二氢杨梅素提取率影响效果不明显，当料液比不变时，随乙醇体积分数增大提取率先增大后减小，说明此条件下乙醇体积分数对二氢杨梅素提取率影响效果明显，从图７（ｂ）可知，乙醇体积分数和料液比的等高线呈圆形，说明乙醇体积分数和料液比对超声波提取藤茶中二氢杨梅素的交互作用不显著。
综合分析响应面试验结果可知，考虑各因素交互作用可知ＡＢ、ＡＣ交互作用不明显即乙醇体积分数与提取时间、乙醇体积分数与料液比交互作用不明显，ＢＣ交互作用明显即提取时间与料液比交互作用明显。
通过Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ．Ｖ８．０对二元回归方程求最大值［１５，１６］，得最佳提取工艺条件为乙醇体积分数５１．４５％、料液比１∶２６．４８、提取时间为４０．９６ ｍｉｎ，提取率为２８．６１％。根据实际情况选取乙醇体积分数为５１．００％、料液比为１∶２６．００、提取时间为４０．００ ｍｉｎ，在此条件下重复试验５次测得二氢杨梅素的实际提取率为２８．４１％，接近理论提取率，ＲＳＤ为１．１６％，说明响应面法建立的藤茶二氢杨梅素提取数学模型具有稳定可靠性，试验结果与模型符合良好。
３ 小结
以梵净山野生藤茶为原料，通过单因素试验，分析了乙醇体积分数、超声波提取时间、料液比对野生藤茶中二氢杨梅素提取率的影响。用Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ．Ｖ８．０软件中的Ｂｏｘ－Ｂｅnｈｎｋｅｎ（ＢＢＤ）中心组合原理设计响应面试验，建立了以乙醇体积分数、提取时间、料液比为自变量，以野生藤茶二氢杨梅素提取率为响应值的多元二次回归数学模型，得出超声波辅助提取梵净山野生藤茶中二氢杨梅素的最佳提取工艺为：乙醇体积分数５１．００％、超声波时间４０．００ ｍｉｎ、料液比１∶２６．００，在此条件下实际提取率为２８．４１％，与Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ．Ｖ８．０分析预测值相差较小，ＲＳＤ为１．１６％，因此认为经优化后的提取条件合理可行。梵净山野生藤茶中二氢杨梅素具有一定的抗氧化、免疫、降血脂、降血糖等保健作用。因此，野生藤茶中二氢杨梅素在食品和医药工业中，具有广泛的开发价值。
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（责任编辑 龙小玲）
