罗 卫，谢纯良，严 理，朱作华，李智敏，胡镇修，彭源德
（中国农业科学院麻类研究所，长沙 ４１０２０５）
摘要：为了寻找有效提取杏鲍菇（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ Ｑｕｅｌ）菌丝胞外酶的方法，为杏鲍菇等食用菌胞外酶的活性研究和生长规律提供试验依据，研究通过ｐＨ ４．８的柠檬酸缓冲液、去离子水２种处理方式提取杏鲍菇菌丝胞外酶，并通过测定８种胞外酶酶活来对这２种方式进行比较分析。结果表明，２种提取方式对杏鲍菇菌丝胞外酶的酶活有差异，其中，酸性纤维素酶和果胶酶经酸处理酶活是水处理的２倍多；木聚糖酶和木质素降解相关酶类经酸处理的酶活也高于水处理，但淀粉酶和蛋白酶经酸处理酶活低于水处理。
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关键词 ：杏鲍菇（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）；胞外酶；酸处理；水处理；比较分析
中图分类号：Ｓ６４６．１＋４ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０２－０427－０4
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０２．０43
研究食用菌胞外酶的活性，对了解不同食用菌的胞外酶分泌特点、活性大小及动态变化趋势、推测不同食用菌在不同生长发育阶段对培养基中木质纤维素、淀粉等大分子营养成分的降解动态、提高栽培技术有重要的意义［１］。在研究胞外酶活性时，能够有效提取菌丝胞外酶是测定酶活性的前提。因此，选择一种有效的提取菌丝胞外酶的方法对研究胞外酶的活性具有重要意义。目前，食用菌胞外酶的提取方法主要有２种：一是用水处理的方式提取［２－４］；二是用酸处理的方式提取［５］。到目前为止，尚未见有人用同一种酶对这两种提取方式进行比较分析。由于仪器和试验操作等方面的误差，使得酸性纤维素酶、果胶酶，木聚糖酶、淀粉酶等胞外酶的提取尚无可以参考的标准。从研究的需要出发，本研究以杏鲍菇（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ Ｑｕｅｌ）菌丝为研究对象，通过酸、水２种不同的处理方式提取杏鲍菇菌丝胞外酶，并通过测定酶的活性对这２种方式进行分析比较，以期找到一种有效的提取胞外酶的方法，为今后杏鲍菇等食用菌胞外酶的提取提供理论参考。
１ 材料与方法
１．１ 供试菌株
杏鲍菇“杏－１”，由湖南省食用菌研究所提供，杏鲍菇栽培采用棉子壳培养基：７１％棉子壳、２１％麦麸、４％玉米粉、２％白糖、２％碳酸钙，自然ｐＨ，含水量６０％。采用常规方式拌料、装袋，１００ ℃灭菌１８ ｈ，冷却后接杏鲍菇栽培种，每一菌袋接栽培种约３ ｇ，置入 ２２～２５ ℃、湿度７５％、ＣＯ２浓度在５００～１ ０００ mg/kg的条件下培养，大概３５ ｄ长满菌丝［６］。
１．２ 试剂
羧甲基纤维素钠、木聚糖、果胶和半乳糖醛酸为Ｓｉｇｍａ公司产品，柠檬酸、无水葡萄糖、木糖、乙酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻联甲苯胺、纤维二糖、丙二酸，丙二酸钠、ＡＢＴＳ、黎芦醇、果胶、硫酸锰、牛血清蛋白、ＰＢＳ缓冲液、考马斯亮蓝染液、酒石酸、双氧水、酒石酸甲钠、３，５－二硝基水杨酸、可溶性淀粉为国产分析纯。
１．３ 试验方法
１．３．１ 粗酶液制备 菌丝长满菌袋后， 在袋中取长满菌丝的培养料充分混匀，然后取４０ ｇ均匀分成２份，一份加去离子水（以下简称水）５０ ｍＬ，一份加ｐＨ ４．８柠檬酸缓冲液（以下简称酸）５０ ｍＬ，２０ ℃振荡浸提４ ｈ，过滤后，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，上清液即为粗酶液。
１．３．２ 木质素降解相关酶类酶活测定
１）漆酶酶活的测定。相关试剂配置和酶活计算公式参照Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ等［７］的方法，其酶活单位定义为１ ｍｉｎ催化ｌ ｍｏｌ底物的酶量。准确移取１００ ｍｍｏｌ／Ｌ丙二酸—丙二酸钠缓冲液、０．６ ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＢＴＳ溶液各１０ ｍＬ。混合摇匀，３０ ℃水浴。取上述混合试剂ｌ ｍＬ于１．４ ｍＬ的比色皿中，４２０ ｎｍ处调零。准确加入待测酶液Ｘ μＬ（Ｘ＝0～５０），立即记录吸光度。每隔３０ ｓ记录１次，共３次。取平均值，折算成每分钟的吸光度变化（ＯＤ４２０变化）。
２）锰过氧化物酶酶活的测定。相关试剂配置和酶活计算公式参照Ｗａｒｉｉｓｈｉ等［８］的方法，其酶活单位定义为ｌ ｍｉｎ氧化１ μｍｏｌ ＭｎＳＯ４的酶量。准确移取１００ ｍｍｏｌ／Ｌ丙二酸—丙二酸钠缓冲液０．５ ｍＬ于１．４ ｍＬ的比色皿中，加入１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＳＯ４溶液０．１ ｍＬ，准确加入待测酶液Ｘ μＬ （Ｘ＝０～５０），加入去离子水（４００－Ｘ） μＬ，３０ ℃水浴，加入浓度为１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈ２Ｏ２溶液０．０１ ｍＬ启动反应，迅速测定２７０ ｎｍ处的吸光度，ｌ ｍｉｎ后再测定１次，计算二者之差，即为每分钟的吸光度变化（ＯＤ２７０变化）。
３）木质素过氧化物酶酶活的测定。相关试剂配置和酶活计算公式参照Ｔｉｅｎ等［９］的方法，其酶活单位定义为１ ｍｉｎ氧化ｌ μｍｏｌ黎芦醇的酶量。准确移取２００ ｍｍｏｌ／Ｌ酒石酸缓冲液０．５ ｍＬ于１．４ ｍＬ的比色皿中，加入４０ ｍｍｏｌ／Ｌ黎芦醇０．１ ｍＬ。准确加入待测酶液Ｘ μＬ （Ｘ＝０～１００），加入去离子水（４００－Ｘ） μＬ，３０ ℃水浴，加入浓度为２０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈ２Ｏ２溶液０．０1 ｍＬ启动反应，迅速测定３１０ ｎｍ处的吸光度，１ ｍｉｎ后再测定１次，计算二者之差，即为每分钟的吸光度变化（ＯＤ３１０变化）。
１．３．３ 酸性纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶酶活的测定
１）酸性纤维素酶酶活的测定。相关溶液和试剂的配置参照Ｍａｎｄｅｌｓ等［１０］的方法，取３支试管各加入０．５ ｍＬ酸性ＣＭＣ底物，与待测酶液一起在５０ ℃水浴中预热５ ｍｉｎ。在第一、二支试管中各加入０．５ ｍＬ待测酶液，５０ ℃水浴中反应１５ ｍｉｎ。在３支试管中各加入３ ｍＬ的ＤＮＳ试剂，然后在第三支试管中加入０．５ ｍＬ的待测酶液。摇匀３支试管后，在沸水浴中煮５ ｍｉｎ。水浴冷却至室温后，以第三支试管为对照在５４０ ｎｍ下测第一、二支试管的吸光度。酶活（ＩＵ／ｍＬ）＝（葡萄糖等量值／１８０／１５／０．５）×稀释倍数。
２）果胶酶酶活的测定。相关溶液和试剂的配置参照王玉万等［１１］的方法，取３支试管各加入０．５ ｍＬ ０．２５％聚半乳糖醛酸溶液，与待测酶液一起在５０ ℃水浴中预热５ ｍｉｎ。在第一、二支试管中各加入０．５ ｍＬ待测酶液，５０ ℃水浴中反应１５ ｍｉｎ。在３支试管中各加入３ ｍＬ的ＤＮＳ试剂，然后在第三支试管中加入０．５ ｍＬ的待测酶液。摇匀３支试管后，在沸水浴中煮５ ｍｉｎ。水浴冷却至室温后，将空白液置４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心机中离心５ ｍｉｎ后取上清液作为空白对照。以第三支试管为对照在５４０ ｎｍ下测第一、二支试管的吸光度。酶活（ＩＵ／ｍＬ）＝（葡萄糖等量值／１８０／１５／０．５）×稀释倍数。
３）木聚糖酶酶活的测定。相关溶液和试剂的配置参照Ｓｈａｍａｌａ等［１２］的方法。采用ＤＮＳ法，取３支试管各加入０．５ ｍＬ中性木聚糖底物，与待测酶液一起在５０ ℃水浴中预热５ ｍｉｎ。在第一、二支试管中各加入０．５ ｍＬ待测酶液，５０ ℃水浴中反应１５ ｍｉｎ。在三支试管中各加入３ ｍＬ的ＤＮＳ试剂，然后在第三支试管中加入０．５ ｍＬ的待测酶液。摇匀３支试管后，在沸水浴中煮１０ ｍｉｎ。水浴冷却至室温后，将显色液（包括空白）以４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ。取上清液以第三支试管为对照在５４０ ｎｍ下测第一、二支试管的吸光度。酶活（ＩＵ／ｍＬ）＝（葡萄糖等量值／１５０／１５／０．５）×稀释倍数。
１．３．４ 淀粉酶、蛋白酶酶活的测定
１）淀粉酶酶活的测定。相关溶液和试剂配置参照管道平［５］的方法，在３支试管中加入1％可溶性淀粉溶液1 ｍＬ，加入ｐＨ ４．８、０．１ mol/L柠檬酸缓冲溶液４ ｍＬ，去离子水1 ｍＬ，在第一、第二支试管中加入酶液ｌ ｍＬ，４０ ℃水浴中保温３０ ｍｉｎ。在３支试管中各加入３ ｍＬ的ＤＮＳ，然后在第三支试管加入１ ｍＬ的酶液。摇匀３支试管在沸水浴中煮５ ｍｉｎ。水浴冷却至室温后，以第三支试管为对照在５４０ ｎｍ下测第一、二支试管的吸光度。酶活单位定义为每小时酶促生成ｌ ｍｇ葡萄糖的酶量。
２）蛋白酶酶活的测定。相关溶液和试剂的配置参照Ｂｒａｄｆｏｒｄ［１３］的方法，将适当体积的样品加入到试管中，并用ＰＢＳ补足到１５０ μＬ，向各试管中加入２．８５ ｍＬ的考马斯亮蓝染液，混匀，温室放置５～１０ ｍｉｎ，用分光光度计测定５９５ ｎｍ处的吸光度，并记录读数，以不含ＢＳＡ的样品作为空白对照，绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。
２ 结果与分析
２．１ 木质素降解相关酶类酶活测定结果
木质素降解相关酶类经酸、水处理后所测得的酶活如表１和图１所示。由图１可知，木质素相关酶类酶活酸处理与水处理相比有差异，酸处理酶活均高于水处理酶活。
２．２ 酸性纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶酶活测定结果
酸性纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶经酸、水处理后所测得的酶活如表２和图２所示。由图２可知，杏鲍菇菌丝经酸处理酶活与水处理相比有显著差异，其中酸性纤维素酶酸处理酶活是水处理的2倍多；果胶酶酸处理酶活是水处理的2倍多，木聚糖酸处理酶活是水处理的１倍多。
２．３ 淀粉酶、可溶性蛋白酶酶活测定结果
淀粉酶、可溶性蛋白酶经酸、水处理后所测得的酶活如表３和图３所示。由图３可知，杏鲍菇菌丝酸处理酶活与水处理相比有差异，酸处理酶活低于水处理。
３ 小结与讨论
本研究采用２种不同的处理方式提取杏鲍菇菌丝胞外酶，并对２种处理方式的结果进行比较分析。试验结果表明，酸性纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶经酸处理后测定的酶活与水处理相比有差异，其中酸性纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶酸处理酶活与水处理相比有显著的差异。但淀粉酶和蛋白酶的酸处理酶活不及水处理效果，初步分析，可能是淀粉酶和蛋白酶的最适ｐＨ接近中性，而ｐＨ ４．８的柠檬酸缓冲液偏酸性，抑制了部分淀粉酶和蛋白酶的活性，从而导致所测得酶活低，但是具体的反应机理还需进一步研究。
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（责任编辑 龙小玲）
