杨金凤ａ，ｂ，黄玉琴ｂ，呼丽萍ａ，ｂ
（天水师范学院，ａ．甘肃省大樱桃工程技术研究中心；ｂ．生命科学与化学学院，甘肃 天水 ７４１００１）
摘要：采用钼蓝比色法测定甜樱桃中还原型ＶＣ含量，探讨了此方法的最佳测定条件。结果表明，钼蓝比色法的最大吸收峰为８５０ ｎｍ，５％硫酸溶液和５％钼酸铵溶液的最佳用量分别为１．５０ ｍＬ和３．００ ｍＬ，最适反应时间为１４ ｍｉｎ，在此条件下测得Ｒ２为０．９９８ ７。优化后的测定方法变异系数小于５ ％，平均回收率为９８．５２％，还原型ＶＣ含量在０．００～０．１２ ｍｇ/５０ ｍＬ内呈良好的线性关系。该方法准确、快速、稳定，适合少量和批量样品的测定。用此法测得天水甜樱桃样品中的还原型ＶＣ的平均含量为２． ０３２ ｍｇ/１００ ｇ。
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关键词 ：钼蓝比色法；ＶＣ；甜樱桃
中图分类号：Ｏ６５７．３２ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）01－181-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.01.047
Optimizing the Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ－ｔｙｐｅ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｉｎ Ｓｗｅｅｔ Ｃｈｅｒｒｙ
ＹＡＮＧ Ｊｉｎ－ｆｅｎｇａ，ｂ，ＨＵＡＮＧ Ｙｕ－ｑｉｎｂ，ＨＵ Ｌｉ－ｐｉｎｇａ，ｂ
（Ｔｉａｎｓｈｕｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ａ．Ｇａｎｓｕ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｓｗｅｅｔ Ｃｈｅｒｒｙ； ｂ．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｔｉａｎｓｈｕｉ ７４１００１， Ｇａｎｓｕ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Mｏｌｙｂｄｅｎｕｍ ｂｌｕｅ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ used ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｉｎ ｓｗｅｅｔ ｃｈｅｒｒｙ ａｎｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ of ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｓｔｒｏｎｇ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｔ ８５０ ｎｍ． Tｈｅ ｄｏｓａｇｅ ｏｆ ５％ ｓｕｌｆｕｒｉｃ－ａｃｉｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，５％ ｍｏｌｙｂｄａｔｅ－ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗｅｒｅ １．５０ ｍＬ ａｎｄ ３．００ ｍＬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Tｈｅ ｏｐｔｉｍal ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ １４ ｍｉｎ． Ｔｈｅ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ５%， with ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ of ９８．５２％． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ had ａ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ０．００～０．１２ ｍｇ/５０ ｍＬ． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｃｃｕｒａｔｅ， ｒａｐｉｄ， ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎing ｓｍａｌｌ－ａｍｏｕｎｔ ａｎｄ ｂａｔｃｈ ｓａｍｐｌｅｓ． Tｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ－ｔｙｐｅ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ｉｎ ｓｗｅｅｔ ｃｈｅｒｒｙ ｏｆ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ｗａｓ ２．０３２ ｍｇ/１００ ｇ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ ｂｌｕｅ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｍｅｔｈｏｄ； ｖｉｔａｍ Ｃ； ｓｗｅｅｔ ｃｈｅｒｒｙ
收稿日期：２０１４－０３－１４
基金项目：甘肃省科技厅农业科技成果转化资金计划项目（１１０５ＮＣＮＥ１０９）；甘肃省国家星火引导计划项目（２０１２ＧＡ）
作者简介：杨金凤（１９７６－），女，甘肃甘谷人，讲师，硕士，主要从事植物营养和生态学方面的研究，（电话）１３９９３８８３９３１（电子信箱）ｓｘｓｕｓａｎ＠１２６．ｃｏｍ；
通信作者，呼丽萍，研究员，主要从事果树栽培技术研究，（电子信箱）ｈｕｌｉｐｉｎｇ＠１６３．ｃｏｍ。
目前，果蔬中还原型ＶＣ的测定方法很多，如高效液相色谱法［１－３］、荧光分光光度法［４－６］、原子吸收光谱法［７，８］、紫外分光光度法［９－１１］、滴定分析法［１２］、钼蓝比色法［１３－１５］等，其中，高效液相色谱法、荧光分光光度法和原子吸收光谱法要求样品的纯度较高，还需要有昂贵的仪器，无法应用普及；紫外分光光度法中２，４－二硝基苯肼比色法操作麻烦，耗时较长；２，６－二氯靛酚法操作简便且应用最普遍，但是药品价格昂贵，而且多数果蔬样品提取液都有颜色，使滴定终点不易确定，有的即使用脱色剂也很难脱色完全，且造成ＶＣ的损失；碘量法需标定碘液，比较麻烦、费时。相比之下，钼蓝比色法操作简便，不易受样品提取液颜色的影响，在有偏磷酸存在下， 样品中的还原性物质对测定结果也无明显影响，专一性较强，反应迅速，反应产物较稳定。利用钼蓝比色法测定食品中还原型ＶＣ已有一些研究报道，但在实际应用中，有些试验条件、特别是关于最大吸收波长的报道很不一致［１６－１８］，因此，本研究对测定的最大吸收峰、钼酸铵和酸性介质的用量以及反应时间等条件作了进一步的研究，确定了钼蓝比色法测定甜樱桃中还原型ＶＣ的最佳实验条件。
１ 材料与方法
１．１ 材料与仪器
供试甜樱桃样品于２０１２年６月初采自天水师范学院植物园，品种为“美早”。
ＵＶ３０１０ 紫外分光光度计（日本日立公司）；ＦＡ１００４ 电子天平（上海越平科学仪器公司）。
１．２ 方法
１．２．１ 溶液配制 ①５％钼酸铵溶液：准确称钼酸铵２５．００ ｇ，加适量水溶解定容至５００ ｍＬ；②草酸－ＥＤＴＡ溶液：草酸０．０５ ｍｏｌ/ｍＬ、０．２０ ｍｏｌ/ｍＬ ＥＤＴＡ，精确称取草酸６．３００ ｇ（含结晶水），ＥＤＴＡ ０．０５８ ４ ｇ，充分溶解并定容到１０００ ｍＬ；③５％盐酸溶液：吸取５ ｍＬ的浓盐酸稀释至１００ ｍＬ；④５％硫酸溶液：吸取５ ｍＬ的浓硫酸稀释至１００ ｍＬ；⑤５％硝酸溶液：吸取５ ｍＬ的浓硝酸稀释至１００ ｍＬ；⑥偏磷酸－醋酸溶液：摇动溶解１５ ｇ片状偏磷酸于４０ ｍＬ醋酸中，稀释至５００ ｍＬ，用滤纸过滤，取滤液备用；⑦标准ＶＣ溶液：准确称取６０ ℃真空干燥２ ｈ的ＶＣ ０．０５０ ０ ｇ，用上述配好的草酸－ＥＤＴＡ溶液定容于５００ ｍＬ的容量瓶中，使标准溶液浓度达到１ ｍｇ／ｍＬ；所用试剂均为分析纯，试验用水均为去离子水。
１．２．２ 样品处理及测定方法 将样品用去离子水洗净后擦干、捣碎，准确称取１０．００ ｇ于研钵中，加入１０ ｍＬ草酸－ＥＤＴＡ溶液，快速研磨成匀浆后转入５０ ｍＬ容量瓶，用草酸－ＥＤＴＡ溶液定容后用高速冷冻离心机以１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，吸取１０ ｍＬ的上清液于５０ ｍＬ容量瓶中，加入１．００ ｍＬ的偏磷酸－醋酸溶液和２．００ ｍＬ的５％硫酸溶液摇匀后，再加入４．００ ｍＬ的钼酸铵溶液，用去离子水定容至５０ ｍＬ，１５ ｍｉｎ后以试剂空白为参照，在８５０ ｎｍ处测定。
１．２．３ 试验设计 ①最大吸收峰的选择：准确吸取１．００ ｍL的ＶＣ标准溶液于５０ ｍｌ 容量瓶中用去离子水定容，然后以去离子水为空白置于１ ｃｍ石英比色皿中，在６００～１ ０００ ｎｍ内进行连续光谱扫描，确定ＶＣ最大吸收峰；②钼酸铵用量的选择：分别吸取１．００ ｍＬ的标准ＶＣ溶液于５０ ｍＬ容量瓶中，加入１．００ ｍＬ偏磷酸－醋酸溶液和２．００ ｍＬ ５％硫酸溶液，摇匀后分别加入１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５ ｍＬ钼酸铵溶液，按试验方法进行测定，选出最适钼酸铵用量；③硫酸用量的选择：分别吸取１．００ ｍＬ的标准ＶＣ溶液于５０ ｍＬ容量瓶中，加入１ ｍＬ偏磷酸－醋酸溶液，再分别加入０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０ ｍＬ ５％硫酸溶液，摇匀后加入３ ｍＬ钼酸铵溶液，按试验方法进行测定，分析酸度对反应的影响，选出最适酸液的用量；④反应时间的选择：吸取１．００ ｍＬ的标准ＶＣ溶液于５０ ｍＬ容量瓶中，加入１ ｍＬ偏磷酸－醋酸溶液和１．５ ｍＬ ５％硫酸溶液，摇匀后加入３ ｍＬ钼酸铵溶液，放置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０ ｍｉｎ后，按试验方法进行测定，考察时间对反应的影响，选出最佳反应时间；⑤精密度和回收率的测定：准确称取１００ ｇ甜樱桃，再加入一定量的草酸－ＥＤＴＡ溶液，经捣碎后移人50 ｍＬ容量瓶中定容、过滤，其上清液即为待测样品的提取液。吸取２．００ ｍＬ的提取液，加入１．００ ｍＬ的偏磷酸－醋酸溶液，５ ％的硫酸１．５０ ｍＬ，摇匀后，加人３．００ ｍＬ钼酸铵溶液，用去离子水定容至５０ ｍＬ，１４ ｍｉｎ后，测定吸光度，平行测定６次。吸取２．００ ｍＬ的提取液加入标准溶液０．５０ ｍＬ，其他试剂同上，定容到５０ ｍＬ，１４ ｍｉｎ后测定吸光度。
２ 结果与分析
２．１ 最大吸收峰的选择
吸收峰的大小决定着方法的灵敏度，只有选择合适的波长，才能减少系统误差，提高测定的准确度。由图１可知，随着波长的增大，蓝色络合物的吸光度先上升而后呈下降趋势，在８５０ ｎｍ处有最大吸收峰，故本试验选择８５０ ｎｍ为测定波长。
２．２ 钼酸铵用量的选择
由图２可知，随着钼酸铵用量的不断增加，吸光度不断增大，在３．００ ｍＬ左右达到最大值，大于３．００ ｍＬ后其吸光度略有下降，之后无明显变化，说明过量的钼酸铵对反应并无多大的影响，因此钼酸铵的最佳用量为３．００ ｍＬ。
２．３ 酸度的选择
由图３可知，随着硫酸用量的不断增加，吸光度先呈直线增加，当硫酸用量超过０．６０ ｍＬ后，吸光度虽有增加，但增加幅度减缓，在１．５０ ｍＬ达到最大值，之后吸光度又有所下降，但下降幅度不大，也就是说硫酸在１．００～３．５０ ｍＬ时吸光度较稳定。说明在此范围内有利于稳定抗坏血酸，促进钼蓝络合物的生成，使显色反应进行得比较彻底。但当硫酸的用量超过３．５０ ｍＬ后，吸光度下降很快。这可能是溶液中酸度过大，使抗坏血酸过于稳定，从而减缓了显色反应， 不能使钼酸铵充分显色的原因。因此，本试验５％硫酸溶液的适宜用量为１．５０ ｍＬ。
２．４ 反应时间的选择
从图４中可以清晰看出，在１４ ｍｉｎ之前，随着时间的延长，吸光度在不断增加，这是由于抗坏血酸与钼酸铵的反应不彻底，还没有达到颜色的最大强度；在１４ ｍｉｎ时吸光度达到最大值，之后吸光度的连线近似直线，而且可以稳定在１４～２０ ｍｉｎ，也就是说，在此范围内吸光度非常稳定，可以满足测定时间的要求，这同李军［１4］研究相符。故本试验的最佳反应时间为１４ ｍｉｎ。
２．５ 标准曲线的绘制
在优化的试验条件下，分别吸取０．０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２ ｍＬ的标准ＶＣ溶液于５０ ｍＬ容量瓶中，加入１ ｍＬ偏磷酸－醋酸溶液和１．５ ｍＬ ５％的硫酸溶液，再加入３ ｍＬ钼酸铵溶液后定容并摇匀，放置１４ ｍｉｎ后，以试剂空白为参照在８５０ ｎｍ处测定其吸光度值。以标准ＶＣ溶液的浓度（ｍｇ／５０ ｍＬ）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制曲线，得回归方程Ａ８５０ ｎｍ＝０．４００ ２ Ｃ，Ｒ２＝０．９９８ ７（图５）。结果表明，ＶＣ浓度在０．００～０．１２ ｍｇ／５０ ｍＬ内吸光度与ＶＣ含量呈良好的线性关系，服从比尔定律。
按制作标准曲线的方法对６个甜樱桃样品中还原型ＶＣ含量进行测定，３次重复，最终测定了甜樱桃还原型ＶＣ平均含量为２． ０３２ ｍｇ/１００ ｇ。
２．６ 回收率试验
回收率试验结果表明，回收率为９６．５０%～１００．６９％（表１）。
３ 小结与讨论
通过试验确定了钼蓝比色法测定甜樱桃中还原型ＶＣ的最佳条件，建立了一种简便、快速、稳定的测定甜樱桃中还原型ＶＣ的方法，该法同样适合其他果蔬中还原型ＶＣ的测定。
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（责任编辑 胡西洲）
