李丹花，乔莉娟，岳 丹，昝立峰，段保宁，白兰所
（邯郸学院生命科学与工程学院，河北 邯郸 ０５６００５）
摘要：从邯郸地区堆肥中分离出５株具有纤维素降解能力的菌株，纤维素降解能力的初步鉴定结果显示，Ｍ１菌株具有较强的纤维素降解能力。对Ｍ１菌株进行分子鉴定和生长特性的初步鉴定，结果表明，Ｍ１菌株应当归属于假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．），菌株的温度生长范围为１０～４５ °Ｃ，最适生长温度为３０ °Ｃ，ｐＨ ６～８菌株均可生长，最适条件为ｐＨ ６。
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关键词 ：土著菌；纤维素降解；假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）；生长特性
中图分类号：Ｘ７０５ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）16－3884-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.013
收稿日期：２０１５－０５－１４
基金项目：邯郸市科技计划项目（１３２２１０１０６５－４）；邯郸学院校内委托项目（１４３０１）
作者简介：李丹花（１９８２－），女，河南平顶山人，讲师，博士，主要从事微生物学研究，（电话）18631020970（电子信箱）ｙｄ＿ｌｄｈ＠１６３．ｃｏｍ。
当前，农村环境污染日趋严重，尤其是农村生活垃圾、畜禽养殖废弃物及农作物秸秆等主要农村固体废弃物已成为污染农村环境的主要因素，影响着农村建设的进程。堆肥化处理技术是解决农村固体废弃物问题的一个重要途径，是目前使废弃物无害化、减量化和资源化的关键技术［１］。在高纤维含量的堆肥或者添加秸秆、木屑等调节剂［２］的堆肥处理中，其成分和结构复杂，难以被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用，已成为缩短堆肥周期、提高堆肥效率的限制性因素，因此，纤维素的生物降解成为堆肥技术处理有机固体废弃物的关键，一些研究者就堆肥纤维素分解菌进行了研究，筛选出很多高效的降解菌株［３，４］。
有研究表明，在堆肥过程中强化接种高效微生物菌株可以增加堆体中的微生物数量，利用微生物菌群间的相互协同作用促进堆肥材料的腐熟，提高堆肥效率，但是由于堆肥物料成分复杂，接种外源微生物菌株与堆肥土著微生物之间有时也存在竞争，致使二者均不能充分发挥其作用［５，６］。因此，如能将土著菌的高效菌株强化接种到堆肥中，将能更好地发挥微生物菌剂的作用，加快固体废弃物中有机物的分解，提高堆肥腐熟度。
本研究从邯郸地区堆肥中筛选到一株降解纤维素的高效土著菌，并对其进行分子鉴定，初步研究其生长特性，旨在为堆肥提供优良纤维素分解菌株，加快堆肥中纤维素的分解，以进一步优化堆肥进程。同时也为构建土著菌组成的高效微生物菌剂奠定基础［７］。
１ 材料与方法
１．１ 样品的采集和处理
猪粪堆肥样品采自邯郸市种猪场常年堆肥车间。取腐熟堆肥发酵物带回实验室。取腐熟发酵物１ ｇ放入无菌锥形瓶中，加入９ ｍＬ蒸馏水稀释至0.1 g/mL，加入玻璃珠振荡培养１ ｈ备用。
１．２ 培养基配方
羧甲基纤维素钠培养基组分为：ＣＭＣ－Ｎａ １０．００ ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １．００ ｇ、ＮａＣｌ ０．１０ ｇ、ＭｇＳＯ４ ·７Ｈ２Ｏ ０．３０ ｇ、ＮａＮＯ３ ２．５０ ｇ、ＦｅＣｌ３ ０．０１ ｇ、ＣａＣｌ２ ０．１０ ｇ、琼脂 １８．００ ｇ、蒸馏水１ Ｌ；刚果红纤维素琼脂培养基组分为：ＣＭＣ－Ｎａ １０．００ ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １．００ ｇ、ＮａＣｌ ０．１０ ｇ、ＭｇＳＯ４ ·７Ｈ２Ｏ ０．３０ ｇ、ＮａＮＯ３ ２．５０ ｇ、ＦｅＣｌ３ ０．０１ｇ 、ＣａＣｌ２ ０．１０ ｇ、刚果红 ０．２０ ｇ、琼脂 １８．００ ｇ、蒸馏水１ Ｌ；ＬＢ培养基组分：蛋白胨１０ ｇ，酵母提取物５ ｇ，ＮａＣｌ １０ ｇ，琼脂１５ ｇ，蒸馏水１ Ｌ，ｐＨ ７．０。所有培养基于１２１ ℃下灭菌３０ ｍｉｎ备用。
１．３ 菌种的分离纯化
发酵物菌液按照梯度稀释法稀释，取稀释度为１０－２～１０－５的悬浊液２００ μＬ分别涂布于羧甲基纤维素钠分离培养基中培养，培养物放入２８ ℃恒温箱培养，将长出的菌落接种至ＬＢ培养基上进行划线纯化。
１．４ 分解纤维素能力鉴定
将纯化好的菌株点接到刚果红纤维素琼脂培养基上，２８ ℃恒温箱培养５ ｄ，量取透明圈直径（Ｄ）和菌圈直径（ｄ），并计算出比值HC（D/d）,从而判定菌株的纤维素分解能力。
１．５ 菌株的分子鉴定
用细菌ＤＮＡ提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）提取细菌基因组ＤＮＡ，以基因组ＤＮＡ为模板，２７Ｆ和１ ４９２Ｒ为１６Ｓ ｒＤＮＡ引物进行分子鉴定。ＰＣＲ产物琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）回收大约１．５ ｋｂ的目的条带，连接到ｐＧＭ－Ｔ载体（北京索莱宝科技有限公司）上，转化至Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α感受态细胞中，将阳性重组子送北京擎科新业生物技术有限公司测序。将测定得到的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列通过ＢＬＡＳＴ软件与ＧｅｎＢａｎｋ中相关序列进行比对，并利用ＭＥＧＡ ５．０软件进行聚类分析构建进化树。
１．６ 不同温度对菌株Ｍ１生长的影响
将Ｍ１菌株的菌液以１％的接种量接种于５ ｍＬ ＬＢ培养基中，分别培养于１０、１５、２０、 ２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５和６０ ℃系列摇床内，摇床转速为１００ ｒ/ｍｉｎ，２ ｄ后测定菌株的生长量。每个处理重复３次。
１．７ 不同ｐＨ对菌株Ｍ１生长的影响
将Ｍ１菌株的菌液以１％的接种量分别接种于ｐＨ ２．０、４．０、６．０和８．０的５ ｍＬ ＬＢ培养基中，置于３０ ℃、１００ ｒ／ｍｉｎ 的摇床上培养，２ ｄ后测定菌株的生长量。每个处理重复３次。
２ 结果与分析
２．１ 菌株分解纤维素能力鉴定
腐熟发酵物样品经羧甲基纤维素钠培养基分离培养和ＬＢ培养基划线纯化培养后共得到５株形态不同的菌株，分别命名为Ｍ１－Ｍ５。５株菌都可以在羧甲基纤维素钠培养基上生长，具有降解纤维素的能力。同时测定菌株在刚果红纤维素琼脂培养基中生长时的ＨＣ值（Ｄ/ｄ），对筛选到的菌种进行分解纤维素能力的初步鉴定，结果如表１所示。
Ｍ１－Ｍ５菌株的ＨＣ值表明，Ｍ１菌株的ＨＣ值最高。前人研究表明［４］，ＨＣ值超过２．５０的菌株纤维素酶活性高，Ｍ１菌株的ＨＣ值为２．５０，具有较强的纤维素降解能力。
２．２ 菌株鉴定结果
将菌株Ｍ１的１６Ｓ ｒＤＮＡ测序结果用ＢＬＡＳＴ软件进行同源性比较，菌株Ｍ１的系统发育树如图１所示。结果表明，Ｍ１菌株序列与多个假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）菌株的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列相似性都达到９９％，与Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣ５菌株处在同一个分支上，因此，将菌株Ｍ１归属于Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．。
２．３ Ｍ１菌株生长特性
Ｍ１菌株生长特性如图２所示，由图２可知，菌株的温度生长范围为１０～４５ ℃，最适生长温度在３０ ℃左右，当温度高于４５ ℃时，菌株几乎不能生长。ｐＨ ６～８条件下菌株均可生长，最适条件为ｐＨ ６，ｐＨ＜４或ｐＨ＞１０，菌株均不能生长。
３ 小结与讨论
本试验从腐熟堆肥发酵物中筛选到５株形态不同的菌株。分别命名为Ｍ１－Ｍ５。５株菌都可以在羧甲基纤维素钠培养基上生长，具有降解纤维素的能力。同时测定菌株在刚果红纤维素琼脂培养基中生长时的ＨＣ值，Ｍ１菌株的ＨＣ值最高（２．５０），具有较强的纤维素降解能力。
对菌株Ｍ１进行分子鉴定，结果表明，Ｍ１菌株序列与多个假单胞菌属菌株的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列相似性都达到９９％，与Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣ５菌株处在同一个分支上，因此，将菌株Ｍ１归属于Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．。对假单胞菌属菌株降解性能的研究多集中于降解有毒有害物质［８］，如降解蛋白质、淀粉及脂肪等［９］，但对该属中纤维素降解菌的研究较少，因此，该菌在菌株综合应用中具有较大的潜力。
初步测定菌株Ｍ１的生长特性，结果表明，菌株的温度生长范围为１０～４５ ℃，最适生长温度为３０ ℃，高于４５ ℃时菌株几乎不能生长，可以据此判定此菌为中温型细菌。ｐＨ ６～８条件下菌株均可生长，最适条件为ｐＨ ６，ｐＨ＜４或ｐＨ＞１０时菌株均不能生长。
本研究着眼于筛选邯郸地区堆肥中具有较高纤维素降解能力的土著菌，并对高效的土著菌菌株进行分子鉴定和生长特性的初步鉴定。此研究为具有高效纤维素降解能力的土著菌的堆肥应用提供理论基础和实践依据，具有较大的应用潜力。同时为制备高效的新型微生物菌剂奠定基础。
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参考文献：
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［４］ 王志超，陆文静，王洪涛．好氧堆肥中高温纤维素分解菌的筛选及性状研究［Ｊ］．北京大学学报（自然科学版），２００６，４２（２）：２５９－２６４．
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［６］ 徐 智，张陇利，张发宝，等．接种内外源微生物菌剂对堆肥效果的影响［Ｊ］．中国环境科学，２００９，２９（８）：８５６－８６０．
［７］ 辛世杰，李 剑，王 涛．不同微生物菌剂对猪粪堆肥效果的影响［Ｊ］．北方园艺，２０１１（２３）：１４１－１４４．
［８］ ＨＯＮＧ Ｈ Ｂ，ＮＡＭ Ｉ Ｈ，ＭＵＲＵＧＥＳＡＮ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ dｉｂｅｎｚｏ－ｐ－ｄｉｏｘｉｎ， dｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ， ａｎｄ cｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ－ｐ－ｄｉｏｘｉｎｓ ｂｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ ＰＨ－０３［Ｊ］． Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ， ２００４，１５（５）： ３０３－３１３．
［９］ ＧＲＯＵＤＩＥＶＡ Ｔ， ＫＡＭＢＯＵＲＯＶＡ Ｍ，ＹＵＳＥＦ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｌｄ－ａｃｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ aｒｃｔｉｃ ｓｅａ ｉｃｅ， Ｓｐｉｔｚｂｅｒｇｅｎ［Ｊ］． Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ， ２００４，８： ４７５－４８８．
