刘泽军，何天明，赵越，殷文娟
（新疆农业大学林学与园艺学院，新疆 乌鲁木齐 830052）
摘要：本实验采用真空渗透离心法离取库尔勒香梨叶片质外体汁液，综合考量叶片汁液离出率、离心液样品与叶片质量比、离心液样品纯度，得到离取纯净香梨叶片质外体的离心力条件为4000~5000xg，温度4℃，离心时长为10min。本实验为库尔勒香梨叶片质外体汁液成分的研究提供了技术支撑。
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关键词 ：库尔勒香梨叶片；质外体；离心力
收稿日期：2014-05-12
基金项目：国家自然科学基金项目（31160382）；新疆维吾尔自治区果树学重点学科资助项目（201007）。
通讯作者：何天明（1970-），博士，教授，研究方向为果树栽培技术研发。E-mail：hetianming@eyou.com。
高等植物的质外体由细胞膜外侧的构成细胞壁的纤维和微晶体空间及充满水和空气的细胞间隙所组成，分化完成的木质部也属于质外体。从分布上看，质外体分布于植物的各个组织中。近年来，越来越多的研究表明：植物体对空气污染物的解毒、水分的吸收、害虫的防御、离子物质的吸收转运、营养物质的贮存、缺乏和过量中毒的反应、信号的传导（如植物激素）等都需要质外体的参与，因此，质外体对高等植物有非常重要的意义。目前，对植物营养研究而言，根系质外体的研究已有较多相对成熟的方法，但叶片质外体却是难点，原因在于缺乏有效的令人信服的方法提取叶片质外体液体，从而去了解质外体的组成。
科研工作者常采用微电极、射线能谱分析仪、离子敏感荧光染色计来测定质外体溶液中的离子浓度；采用压力室法、灌注法、洗脱法、渗透离心法来获取叶片中质外体汁液。Dannel等将灌注法和离心法相结合来提取叶片质外体汁液，效果较好。林杉等在把磷酸己糖异构酶（HPI）作为标志性酶的基础上，采用渗透离心法获得了蚕豆叶片质外体汁液。但是，不同植物因离心条件差异较大，离取质外体汁液时离心力也是不同的。本实验为有效离取香梨叶片质外体汁液，采用渗透离心法，综合考量离心液样品纯度、离取率和离心液样品质量与叶片质量比，以此来确定合适的离心力。
1材料与方法
1.1材料及来源
1.1.1植物材料
试验材料来源于新疆巴州沙依东园艺场二分场，树体为20年生香梨树。采集正常香梨树不同方位当年生枝条中部正常绿叶300片。叶片自叶柄处剪下，迅速装入有小孔的自封袋，放进盛有冰袋的保温箱中带回实验室，泡沫箱中的温度一定要小于4℃。
1.1.2主要药品
0.2 mol/LNa2HP04溶液、0.2mol/LNaH2P04溶液和渗透用0.28 mmol/L山梨醇溶液。
酶活力测定用缓冲溶液A （pH=8）：100mmol/L三羟甲基甘氨酸（HEPES）、30mmol/L山梨醇、2mmol/L二硫苏糖醇（DTT）、1mmol/L氯化钙（CaCl2）、1%聚乙烯吡咯烷酮（Polar AT）和1%牛血清蛋白。
酶活力测定用反应介质溶液B（pH=8）：50mmol/LTris、5mmol/L氯化镁（MgCl2）、1mmol/L氯化钠（NaCl）、0.39mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADP+）、0.46U/mL6 -磷酸葡萄糖脱氢酶（G6P -DH）和1.4mmol/L果糖-6-磷酸（F-6-P）。
以上所有试剂均需现用现配。
1.2试验方法
1.2.1香梨叶片质外体汁液的提取
将采回的新鲜香梨叶片用去预冷的离子水洗净、擦干。准确称取完整叶片质量，放入负1个大气压的真空中渗入预冷的0.28mmol/L山梨醇溶液，直到叶片颜色变深，表面有大量小气泡时为止，时间约为8min。叶片从山梨醇溶液取出后去离子水洗净、擦干、称重。将叶片用洗净的塑料膜轻轻卷起，叶柄朝一个方向放入5mL注射器管（注射器管注射端固定有200μL离心管）。将此带有叶片的装置盛入50mL大离心管中，放入Beckman离心机中离心。采用的离心力有1000xg、2000xg、3000xg、4000xg、5000xg、6000xg、7000xg、8000xg、9000xg和10000xg,温度4℃，时间10 min，试验重复6次。
1.2.2香梨叶片匀浆的制备
将采下的新鲜叶片擦净，称取0.5g左右，用液氮快速冷冻，带回实验室后倒入研钵中快速研磨匀浆，用3 mL上述缓冲液A提取HPI，实验操作中温度≤4℃，以防要测定的酶失活，实验重复3次。
1.2.3香梨叶片质外体汁液离出率的计算
离出率以离取汁液的质量与渗透后的叶片质量比率来衡量，以1mg/g FW为界限，小于等于此值为未离出，大于此值为离出。可用公式表示为：
1.2.4磷酸己糖异构酶酶活力测定
1.2.4.1测定原理
磷酸己糖异构酶活性主要取决于如下反应：
F-6-P经HPI催化可以转化为G-6-P：再经G6P-DH催化生成6-磷酸葡萄糖内酯。其中，后一步为限速步骤，所产生的NADPH可以用来计算相应的酶活力。
1.2.4.2 酶活力计算
1个酶活力单位定义为：在25℃、0.2MPBS、pH8.0条件下，氧化1μmolNADPH所需的酶量。根据朗伯比耳定律：
A= KbC
（3）
（3）式中：A为吸光度；C为吸光物质的浓度（mol/L）；b为吸收层厚度（cm）；K为消光系数（m-1cm-1）；其中NADPH的消光系数为6.2×103 m-lcm-1。可以得出：
AC（U/ mL-g）=[AA×0.161×Y／（X.W）] （4）
（4）式中：Y为测定液总体积．X为所取酶液的体积．，W为渗透前叶片质量。以此可以计算出HP1的酶活力。
1.2.4.3香梨叶片离心液样品纯度
测定不同离心力下离取的叶片汁液和叶片匀浆中的HPI活力，如果离取的汁液中HPI活力与匀浆中酶活力相比的比率越高，则说明离取汁液样品纯度越低，表示质外体汁液所占离取的汁液的比例越低。离取汁液样品纯度公式为：
离心液样品纯度= 100%-（离心液中酶活力／叶片匀浆中酶活力）×100%
（5）
2结果与分析
2.1不同离心力下叶片质外体离出率分析
由图1可知，在离取香梨叶片质外体汁液过程中，离取汁液的多少并不是随离心力的增大而增多。在3000×g离心力下，香梨叶片离取率为90%，而在6000×g的离心力下，却仅有50%。这可能是在样本较少的情况下，对单个叶片进行离心，叶片之间的个体差异对离出率影响很大，如含水量、叶片的粗糙程度、叶片的大小等。5000xg和7000xg的离心力下叶片汁液离出率是相同的。随着离心力的增大，叶片汁液离出率最终达到100%。虽然6000xg的离出率较周边离心力离出率低，但不能排除此数值作为离取香梨叶片质外体汁液的离心力的大小。
2.2不同离心力下离心液样品与叶片质量比分析
获取叶片质外体汁液的意义在于分析其组成成分，如果离取的质外体汁液量过少，则失去了研究的意义。由图2可知，在4000 xg的离心力下，离心液样品质量与叶片质量比均值仅为8.33mg/g，此离心力下平行测定时最大比为15.72mg/gFW。表明在离心力大小相同情况下，叶片之间的离取量差异较大。5000xg、6000xg、7000xg离心力下，离心液样品质量与叶片质量比在15mg/gFW左右，差异不大。随着离心力的增加，质量比迅速升高，在10000 xg的离心力下，达到43.60mg/gFW。离心力与质量比呈正相关关系。
2.3不同离心力下离心液样品纯度分析
由于要提取的是质外体汁液，不但要求离出率和离心液样品质量与叶片质量比要高，还要求质外体汁液没有受到细胞质汁液的污染。磷酸己糖异构酶（HPI）是高等植物呼吸作用中参与糖酵解途径的一种胞内酶，在质外体中的含量极低，因此可以通过检测其活性来判断离取的质外体汁液是否受到细胞质汁液的污染。从酶活力检测结果看（表1），由于1000xg、2000xg离心力下离取的叶片汁液太少，无法对其中HPI活力进行测定，故数值未列出。从6000xg到10000xg离心力，质外体汁液中HPI占叶片全酶活力皆大于2%，离心液样品纯度皆小于98%。7 000 xg离心力下HPI活力突然升高，质外体汁液中HPI占叶片全酶活力也增高，离心液样品纯度降低。10000 xg离心力下离心液样品纯度最低，与最高者相差3.2%。
3讨论
在3000xg离心力下，香梨叶片离心液样品纯度很高，可以排除在取样时叶柄处被破坏的细胞的污染。随着离心力的增大，叶片内细胞被破坏，因此，质外体汁液中HPI活力逐渐增大。在对香梨叶片质外体汁液离出率和离心液样品与叶片质量比分析时发现，离出率和质量比虽然总体上随离心力的升高而逐渐增大，但个别情况下会出现反常。分析其中原因，主要是香梨叶片个体情况的差异。因此，要求在取样时不但要大量采取典型样品，还要求样品生长发育等情况尽可能一致，尽量减少叶片个体差异造成的误差。
参照林杉、Dannel等的报道，如果香梨叶片离心液样品纯度小于98%，叶片质外体汁液中HPI活力占叶片全HPI活力大于2%，则认为香梨叶片质外体汁液受到了细胞质的污染。在3000xg离心力条件下，此时叶片离心液样品纯度很高，但离心液样品质量与叶片质量比却很低，不能将香梨叶片中质外体汁液全部离心出来，所获得质外体汁液不能够代表香梨叶片质外体汁液含量；在6000xg以上更大的离心力条件下，离心液样品纯度明显减小，说明污染程度增大，此时的离心力离心出的汁液不全是单纯的质外体汁液。
4小结
由离心液样品纯度、叶片汁液离出率、离心液样品质量与叶片质量比综合考量，其中离心液样纯度为主要考虑因素，采用真空渗透离心法提取香梨叶片质外体汁液的条件为：离心力4000~5000xg，离心时间为10min，离心温度为4℃。在此条件下提取的质外体汁液污染少，能真实代表香梨叶片质外体汁液。
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