王常芸，李晓亮，辛国胜，王建玲，王冬梅
（烟台市农业科学研究院，山东烟台265500）
摘要：为了建立更为有效的甘薯茎尖离体脱毒培养及快速繁殖技术体系，选用不同品种的甘薯对外源激素浓度、初次继代转培时间、自来水替代蒸馏水、白糖替代蔗糖等方面进行了试验研究。研究结果表明：以添加外源激素6-BA 0.5~1.0 mg/L 和NAA 0.05~0.2 mg/L 的MS培养基为最佳诱导分化培养基；茎尖接种后13~20 天进行初次继代转培为最佳时间，成苗率最高达74.3%；继代快繁过程中用白糖替代蔗糖、自来水替代蒸馏水，成苗率可达到90%；脱毒苗在生产试验中优势明显，增产幅度为5.2%~68.6%。
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关键词 ：甘薯；茎尖；离体培养；脱毒；快繁
中图分类号：S531 文献标志码：A 论文编号：cjas15010015
基金项目：国家“863”计划子课题“甘薯生物育种技术创新与专用型新品种选育”(2012AA101204)。
第一作者简介：王常芸，女，1966 年出生，山东烟台人，高级农艺师，本科，主要从事甘薯、草莓、花卉、马铃薯等方面生物技术研究。通信地址：265500山东省烟台市福山区港城西大街26号烟台市农业科学研究院，Tel：0535-6352001，E-mail：ytwchy1017@163.com。
收稿日期：2015-01-11，修回日期：2015-03-12。
0 引言
甘薯是中国四大主要粮食作物，也是饲料和轻工业的重要原料[1-3]。但甘薯是无性繁殖作物，在种植过程中极易感染病毒[4]，从而导致种性退化，抗性降低，直接影响了甘薯的品质及产量，严重阻碍了甘薯的生产和利用[5-6]。据估计，中国每年因甘薯病毒病造成的损失高达40 亿元[7-8]。迄今为止，国内外尚无高效的化学防治药物[9-10]。因此，目前采用甘薯茎尖脱毒，是防治病毒病、减轻危害的最有效途径[11-13]。
1960 年Nielsen 首次获得甘薯无病毒植株，国内20 世纪80 年代甘薯茎尖组织培养研究获得成功[14]。1989 年辛淑英[15]用MS+ Kt 2 mg/L+IAA 0.5 mg/L，培养7~14 天，转移到不加激素的MS 培养基上培养成苗。1990 年陈应东等[16] 利用MS + 6- BA 1 mg/L + NAA0.01 mg/L+GA3 1 mg/L和MS+6-BA 2 mg/L，培养6~16天，转移到不加激素的MS 培养基上培养成苗率达73.9%和94.4%。1998 年赵玖华等[17]用培养基MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L 使甘薯茎尖分生组织成苗率达76.5%。唐丽等[18]用MS+ 6-BA 1.0~1.5 mg/L，30天和60 天后各更换一次MS培养基，90 天诱导分化率在50%~60%，芽苗生长正常。文彤明等[19]利用‘高系14 号’品种不经愈伤组织诱导成功培养出甘薯脱毒苗，成苗率为30%~50%。上述研究报道主要集中在激素种类及浓度对甘薯茎尖分生组织成苗及愈伤组织诱导培养基方面，但针对不同品种的优化培养方法、增产效果及降低成本方面的研究尚鲜见报道，为此，笔者从甘薯不同品种需要的外源激素、继代时间、水源、糖源以及脱毒增产效果等方面进行系列研究探讨。以期为建立高效、实用的甘薯脱毒快繁技术体系提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验时间与地点
试验于2010 年4 月—2013 年11 月在烟台市农业科学研究院组培实验室、温室及试验田中进行。
1.2 试验材料
选用本院甘薯所品种资源圃的‘徐18’、‘北京553’、‘遗字138’及本院选育推广的‘烟薯27’、‘烟薯16’、‘烟薯21’、‘烟薯25’、‘烟薯24’、‘烟紫薯3 号’等品种资源。
1.3 试验方法
1.3.1 外植体的选择、消毒与接种挑选长势良好无病症表现的甘薯植株，剪取茎顶端2~3 cm长，除去大叶，然后消毒、接种，方法参见段玉云等[20]。
1.3.2 培养基与培养条件基本培养基选用MS[21-22]，外源激素采用6-BA 和NAA[23]，诱导培养基激素浓度配比见表1。初次继代和快繁继代培养基为MS[24]。琼脂浓度为0.5 g/100 g，糖源（白糖和蔗糖）为3 g/100 g，pH 5.8，培养条件见尚佑芬等[21]。每4 周继代快繁一次[25]。
1.3.3 脱毒检测经过茎尖组织培养获得的苗，只有一部分完全脱除病毒，所以对培养出的试管苗要及时进行病毒检测。检测方法主要有目测法、指示植物嫁接法、血清学检测技术和分子生物学检测技术等[9]。
1.3.4 驯化移栽在本院日光温室，移栽前要将试管苗搬到温室打开瓶盖炼苗，注意移栽时轻轻用水冲净根蒂上的培养基。移栽方法参见曹秀敏[25]。
1.3.5 脱毒增产试验利用小区多年多点对比试验，对‘徐18’、‘北京553’、‘遗字138’、‘烟薯27’、‘烟薯16’、‘烟薯21’、‘烟薯25’、‘烟薯24’、‘烟紫薯3 号’等品种资源进行脱毒甘薯增产效果测定，小区面积一般为66.6~200 m2，3 次重复，随机排列。
1.4 数据分析方法
采用列表比较分析法和Excel 2003。
2 结果与分析
2.1 外源激素对甘薯不同品种茎尖诱导分化效果
将不同品种的甘薯茎尖分别接种于不同激素浓度配比的MS培养基上（表1），CK为不加任何激素的MS培养基，诱导分化结果见表2。在CK培养基上，几乎没有明显变化，而在添加不同浓度6-BA和NAA配比的X1~Z3培养基上都能诱导甘薯茎尖分生组织萌发，但X1~Z3之间不同激素浓度配比对不同品种的甘薯茎尖愈伤组织的诱导及分化率的影响有明显差异，以培养基MS+6-BA 0.5~1.0 mg/L+NAA 0.05~0.2 mg/L 最为有利于愈伤组织的诱导及不定芽的分化。其中‘徐18’、‘北京553’、‘遗字138’等品种以Y2激素浓度配比即添加6-BA l.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L 的培养基为好，不定芽分化率在86.6%以上；‘烟薯16’、‘烟薯25’、‘烟紫薯3 号’等品种以Z1 激素浓度配比即添加6-BA0.5 mg/L、NAA 0.2 mg/L的培养基为好，不定芽分化率在85.3%以上；‘烟薯21’、‘烟薯24’、‘烟薯27’等以X2激素浓度配比即添加6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.05 mg/L的培养基为好，不定芽分化率在83.9%以上。可见，茎尖离体分化培养过程中不同品种的甘薯茎尖对不同激素浓度的配比要求是有差异的。试验中还发现，当6-BA浓度一定时，随NAA浓度的升高，愈伤组织形成率会升高，但不定芽的分化率与愈伤组织的形成率不成正相关。
2.2 初次继代转培时间对分化成苗的影响
在相同培养条件下，对接种一定时间的不同品种甘薯茎尖进行了初次继代转培试验，试验分6~12 天，13~20 天和21~27 天3 个时间段进行统计结果分析（表3），注意转接时要连同愈伤组织一起。由表3 看出，培养时间越长，即初次继代转培时间越晚，产生的愈伤组织量越大，而成苗率却呈现低—高—低变化。其中13~20 天继代转培的茎尖，产生中等大小的愈伤组织，而成苗率却最高，达到74.3%，且苗生长健壮，发育良好；其余时间段继代转培的苗，成苗率低，且苗生长状况不好，出现了细弱和发育大小不均等现象。这可能与产生愈伤组织的大小有关。
2.3 自来水替代蒸馏水、白糖替代蔗糖对比试验甘薯茎尖脱毒快繁继代培养过程中要用到大量蒸馏水和蔗糖，成本很高，为了降低生产成本，在其他培养条件相同情况下，对不同品种的甘薯进行了自来水替代蒸馏水、白糖替代蔗糖的对比试验，统计结果见表4。由试验结果看出，成苗率都达到90%以上，且苗生长状况均表现良好，几乎无明显差异，但比较成本却降低很多。可见，大批量甘薯茎尖脱毒快繁生产中完全可以用自来水替代蒸馏水，用白糖替代蔗糖。有待进一步研究。
2.4 脱毒增产效果
甘薯脱毒苗栽插大田后，表现出明显优势：还苗快，植株健壮，抗逆性强，很少发生病虫害；分枝数增多，光合群体加大；地上部长势旺，生长势强；地下部发根快，结薯早，结薯多，脱毒苗单株块根较普通苗一般多1~3 块；薯块膨大快，不早衰，整齐，皮色鲜艳，商品性好；大、中薯率高；产量、品质显著提高。
小区收获后测产，取其平均值，结果见表5。由表5看出，甘薯不同品种之间增产幅度差异较大，平均为5.2%~68.6%不等。其中推广20~30 年以上的老品种：‘徐18’、‘遗字138’、‘北京553’等，平均产量增长幅度较大，可达到37.0%~68.6%；推广10~20 年的品种：‘烟薯27’、‘ 烟薯21’、‘ 烟薯16’等，平均增产幅度为15.4%~36.1%；近几年推出的品种：‘烟紫薯3 号’、‘烟薯25’、‘烟薯24’等，平均增产幅度为5.2%~8.9%。由试验统计结果看出，甘薯脱毒增产效果随品种不同而差异明显，品种推广种植时间越长，退化、感染病毒程度越加严重，而脱毒增产试验效果更加显著。
3 结论与讨论
外源激素对调节甘薯茎尖分生组织的生长起着重要的作用。不同品种的甘薯在茎尖分化过程中对激素的种类和浓度要求不同，只有适当的浓度配比，才能使芽的分化和生长达到最佳点。原因可能是由于不同甘薯品种茎尖所含内源激素种类和浓度不同，因而在茎尖分生组织培养时也需要不同的外源激素的种类和浓度，进而通过施加不同的外源激素来打破个体内源激素间的平衡，使茎尖培养朝着分化成苗率高的方向发展。本试验以添加6-BA 0.5~1.0 mg/L 和NAA0.05~0.2 mg/L 为最好，有利于茎尖分生组织的分化及成苗。
愈伤组织的诱导是影响不定芽分化成苗的重要因素。在一定时间内愈伤组织的生长对芽的分化、壮苗和成苗起促进作用，但超过一定时间则会起到抑制作用。这可能与愈伤组织的过度生长有关。本研究与前人[11,16,20]研究报道基本一致。但与文彤明等[19]不经过愈伤组织的培养直接成苗的报道不同。本试验以13~20天为最佳初次继代转培时间。
甘薯茎尖脱毒快繁过程中完全可以用自来水替代蒸馏水，白糖替代蔗糖，成苗率可达到90%以上，且试管苗生长状况表现良好，几乎无明显差异，但成本却降低很多。鲜见报道。
甘薯品种之间脱毒增产效果存在较大差异，增产幅度为5.2%~68.6%。这可能与推广种植年限有关，推广种植时间越长的品种，退化、感染病毒程度越加严重，脱毒增产效果越显著。脱毒苗的增产效果随世代数的增加而逐渐下降至接近大田用种，具体种植代数应与品种、土壤及周边环境有关。
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