陶爱群
（湖南环境生物职业技术学院园林系，湖南衡阳421005）
摘要：为建立‘中秋酥脆枣’的组培快繁体系，对外植体消毒时间长短和种类选择、不定芽诱导、不定芽增殖、不定根诱导进行研究。结果表明：最佳外植体是水培枝枣头；该外植体用升汞处理5 min 后，接种于MS（改良）+ 6-BA 2.5 mg/L+ NAA 0.15 mg/L，不定芽诱导率达94%；最适增殖培养基为MS（改良）+6-BA 1.5 mg/L+ NAA 0.5 mg/L，平均不定芽达6.5；1/2MS（改良）+ NAA 0.15 mg/L 为最适生根培养基，不定芽平均生根3.6 个。
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关键词 ：‘中秋酥脆枣’；组织培养；诱导；增殖
中图分类号：S665.1 文献标志码：A 论文编号：2014-0494
基金项目：衡阳市科学技术发展项目“中秋酥脆枣组培快繁技术研究”(2008KJ021)；科技部农业科技成果转化资金项目“中秋酥脆枣中试与示范”(2005EA770013)。
作者简介：陶爱群，女，1974 年出生，湖南宁乡人，讲师，硕士，研究方向：果树组织培养与分子育种。通信地址：421005 湖南省衡阳市石鼓区望城路165号湖南环境生物职业技术学院园林学院，E-mail：Aiquntao2005@163.com。
收稿日期：2014-05-14，修回日期：2014-11-05。
0 引言
‘中秋酥脆枣’是祁东糖枣的一个芽变品种，适应南方高温高湿气候，抗性强适应性广，早果丰产性好，品质优良，成熟期恰逢中秋、国庆，填补了鲜枣的市场空白，经济价值极高[1]。‘中秋酥脆枣’已在湖南、江西、广西、云南、重庆等多个南方省市推广种植，但其育苗采用嫁接方式，所需的繁殖材料多，且从砧木苗的培育至嫁接苗出圃，至少需要3 年以上，耗时长，管理较为困难，使‘中秋酥脆枣’在南方的广泛推广种植受到了影响。早在1994 年王玉国等[2]就对‘骏枣’组织与快繁技术进行了研究。迄今为止已有‘骏枣’[2]、‘吕西枣’[3]、‘桐柏大枣’[4]等多个枣树品种成功再生出完整植株，‘金丝小枣’[5]、‘苹果枣’[6]、‘台湾印度枣’[7]、‘毛叶枣’[8]等品种建立了组培快繁体系。枣类组培外植体选用了休眠枝、水培芽[5]、带腋芽茎段[7-8]、叶片、一年生枝、二次枝、枣头芽[6]，培养基主要为MS、WP、改良MS、H、White、改良WPM 等[5,9]，启动培养选用不同浓度的IBA、IAA、NAA、BA、KT[5,8]等，继植物生长调节剂影响枣的代增殖过程[5,8,10]，亦有研究发现NG在‘临泽小枣’继代过程中可代替植物生长调节剂起作用[11]。生根则多采用不同浓度IBA、NAA[5-7]。虽对枣树组培快繁有较多的研究，但所有的研究对象均为北方枣品种，对南方广泛栽种的‘中秋酥脆枣’组培技术研究目前没有报导。为了能在短期内大量生产‘中秋酥脆枣’苗，解决苗木生产受季节、场地限制的问题，笔者拟建立‘中秋酥脆枣’组织培养技术体系，为探索其苗木生产的新途径奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
研究田间试验于2010 年在祁东县新丰果业公司进行，室内试验在2011 年5 月至2013 年10 月在湖南环境生物学院组培基地进行。
1.2 外植体筛选与消毒
1.2.1 1 年生枝条水培枝试材采自祁东新丰果业公司采穗圃。于2010 年12 月选取生长健壮的1 年生枝条放置于气调库中贮藏或埋于湿砂中至翌年4 月枣芽萌发前取出，放入纯净水置于人工气候室中培养，每3 天换水1 次。采下长1 cm的枣头、枣股，用洗衣粉水浸泡0.5 h，无菌水冲洗后转入超净工作台，用70%的酒精浸泡30 s，分别用0.1%升汞溶液浸泡1、2、3、4、5 min 后无菌水冲洗4~5 遍，接种于不含生长调节剂、蔗糖含量为3%的培养基上，每种材料不同消毒时间均接种40个，20天后统计材料的污染率。
1.2.2 野外1 年生枝条2011 年5 月在祁东新丰果业公司采穗圃选取生长健壮的当年生枣头、枣股、二次枝，用流水冲洗后1 h 后，再用无菌水浸泡0.5 h。后带入超净工作台上，用70%的酒精浸泡30 s，分别用0.1%升汞溶液2、4、6、8、10 min 后无菌水冲洗4~5 遍，接种于不含生长调节剂、蔗糖含量为3%的培养基上，接种数量同水培枝，20天后统计污染率。
1.2.3 最优外植体的筛选将1 年生水培枝新萌发的枣头、枣股，1 年生枣头、枣股及二次枝按最优消毒方式处理后，每种外植体选50 个接种在改良MS+ NAA1.00 mg/L的培养基上，30天后统计褐化率和启动率。
1.3 不定芽诱导
1 年生水培枝上选取生长健壮的枣头（长约1 cm）作为外植体，Y1~Y5 培养基以改良MS[1-2]培养基为基本培养基，生长素和细胞分裂素浓度如表1，每种培养基接种10 瓶，每瓶5 个，30 天后统计启动率，60 天后统计不定芽产生率。
1.4 增殖培养
初代培养出的不定芽，接种于6-BA和NAA浓度（见表1 Z1~Z5）的培养基进行增殖培养。每种培养基接种10 瓶，每瓶5 个，30 天后统计不定芽的再生频率和生长状况。
1.5 不定梢生根
选取长2~3 cm，有一定粗度的不定梢接种于表2S1~S6 培养基上，10 天后转入不含生长素的1/2MS 和1/4MS 基本培养上，每种处理接种25 瓶，每瓶2 个，40天统计不定梢的生根率、生根数和平均根长。
1.6 其他
本研究中，培养条件均为光照与黑暗16 h/8 h，光强为2000 lx，培养基中均添加7.5 g 琼脂和30 g 蔗糖，pH6.0。
2 结果与分析
2.1 外植体消毒与筛选结果
2.1.1 外植体消毒结果从图1~2 可知，无论是水培枝萌发枣头、枣股还是野外一年新生的枣头、枣股和二次枝，经不同消毒处理后均表现为随着表面消毒剂处理时间的增长，污染率呈下降趋势。且消毒处理时间相同时，枣头污染程度较枣股重，二次枝污染较当年生枣头、枣股轻，可能是二次萌发时间较迟，所接触到的微生物较少。水培枝枣头、枣股在相同时间消毒剂处理下比采穗圃所采当年生枣头、枣股轻，应是水培枝放置在人工气候室中培养时减少了与微生物接触机会，以它为来源的外植体携带的微生物量相应减少。
2.1.2 不同外植体的筛选水培枝枣头、枣股5 min，当年生枣头、枣股、二次枝9 min 升汞处理后接种在MS+NAA 1.00 mg/L 培养基上培养30 天后发现，6%水培枝枣头出现褐化，92%材料基部出现不同程度的愈伤化，2%材料在统计时未见有任何反应。从表3 中5 种材料的表现可见，水培枝枣头可作为‘中秋酥脆枣’不定芽诱导的外植体。
2.2 不定芽诱导与生长
将水培枝枣头接种于Y1~Y5 号培养基上，接种5天后，枣头基部开始膨大，到15~20 天时，可见叶腋处出现不定芽，此芽生长迅速，到30 天时部分不定芽已长至1.5 cm长。从表4 可知，随着生长素NAA浓度的升高，枣头启动率上升，而不定芽产生率则先上升后下降，以Y4培养基表现最佳。
2.3 不定芽增殖
将先期组培所得的基础苗中的部分不定芽接种于Z1~Z5 的增殖培养基上，30 天时统计结果见表5。平均增殖率会随着生长素和细胞分裂素浓度的升高而增加，平均不定芽长度则为Z4培养基表现较好。综合快繁对增殖培养阶段的要求，以Z4 培养基最为适于‘中秋酥脆枣’的增殖。
2.4 不定根生长
将2 cm 长的不定梢接种于S1~S6 号生根培养基上，10 天时不定梢基部开始膨大，14~15 天时膨大部分出现愈伤组织，20 天时愈伤组织中出现小突起，此突起越长越大，30 天时可见成形的不定根。从生根情况（表6）看，在0.05~0.15 mg/L 的浓度范围内，随着NAA浓度升高，不定根的产生率、平均生根数和平均根长均呈上升趋势。相同浓度的NAA中，1/2MS 生根率和平均生根数高于1/4MS，平均根长则1/4MS 表现较好。但总体来说，S3 培养最有利于‘中秋酥脆枣’组培苗生根。
3 结论
‘中秋酥脆枣’组培采用1 年生休眠枝条在室内水培后萌发的枣头芽作外植体易于进行消毒处理，外植体诱导率高，培养最易获得成功。MS+ 6-BA2.5 mg/L+NAA 0.15 mg/L 是理想的诱导培养基；而为了获得较理想的增殖倍数和不定芽生长量，MS+ 6-BA1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L 是理想的增殖培养基；在1/2MS+ NAA0.15 mg/L培养基上，‘中秋酥脆枣’生根良好。以上培养基均添加蔗糖30 g/L、琼脂7.5 g/L，pH 6.0。
4 讨论
4.1 外植体选择与灭菌
枣树组织培养选用茎尖、茎段、枣果、叶片等作为外植体，如鸡心枣选用带腋芽茎段[12]，尜尜枣选用生长季节枣头茎段[13]，金丝小枣选用当年生根蘖条水培芽[13]、1年生休眠枝水培芽[14]，酸枣选用休眠枝萌发的枣头茎尖[15]均成功再生。笔者试验表明1 年生休眠枝水培后萌发的枣头芽是中秋酥脆枣组培的最佳外植体，其原因如下：（1）材料来源较多，冬季进行修剪时会产生大量的1 年生枝条；（2）第2 年时，该枝条所携带的营养充足，同时生理活性较强对生长调节剂的诱导较敏感；（3）枝条在室内水培时，所接触的外源微生物相对较少，可以减轻外植体的污染程度，这与代丽等研究[15]结论一致。用枣股芽作外植体培养一段时间后，会萌发但不能成苗，而选择枣头芽作为外植体可形成发育良好的组培苗，是因为枣头芽具备有形成树体骨架和结果枝的潜力，这与尜尜枣[13]研究一致。至于取材时间、取材部位，有待进一步探索。
枣外植体灭菌时，视外植体的污染程度选用不同的消毒方法，消毒时间越长，灭菌效果越好，但外植体受表面消毒剂的伤害也越深，表现为褐化程度增加，诱导率下降，因此灭菌时间长短非常关键，应在消毒效果更好的前提下，尽量缩短灭菌时间，选用更有效的消毒剂。笔者采用二次消毒法，能有效杀灭外植体上的外生菌，与冬枣[16]、台湾青枣[17]类似。‘中秋酥脆枣’水培枝枣头用升汞灭菌5 min 综合效果最好，和鸡心枣[12]、青枣[17]相同，短于冬枣[16]。
4.2 培养基选择
枣类进行组培时，基本培养基选用MS[8,12-13,19-20]、改良MS、H、White、改良WPM[12]，笔者采用改良MS进行‘中秋酥脆枣’组培，能有效再生，这应与基因型差异有关。
进行枣类组培时，TDZ、6-BA、ZT 等细胞分裂素都用来诱导和增殖不定芽，但研究发现不同种类的细胞分裂素使用浓度和作用不同，如6-BA在枣类组培上的使用浓度范围为0.5~5.0 mg/L[8,12]，TDZ 为0.005~0.01 mg/L[21]，6-BA可单独应用于枣的不定芽诱导，而低浓度TDZ、ZT 在枣类不定芽诱导中可与6-BA协同作用，但不同再生阶段作用浓度不同。‘中秋酥脆枣’不定芽诱导和增殖的最适6-BA浓度分别为2.5、1.5 mg/L，这应是不同枣类品种间基因型的差异导致植物材料内源激素水平差异所致。
NAA、IAA、IBA[12-14,21-22]等生长素均可用于诱导枣类愈伤组织产生、不定芽生长和生根。IBA是一种广泛应用于枣类组培的生长素，诱导效果好，但IBA售价较高，快繁时应考虑成本问题，故笔者取NAA作为生长素应用于‘中秋酥脆枣’的不定芽和生根诱导。
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