侯晓强，付亚娟，袁建平，吴智艳，王利冉，李 微
（廊坊师范学院生命科学学院/河北省高校食药用菌应用技术研发中心，河北 廊坊 065000）
摘要：对大花杓兰（Cypripedium macranthum Sw．）内生真菌类群组成及多样性进行了分析。结果表明，从大花杓兰植株中分离到内生真菌59 株，利用ITS－rDNA序列分子鉴定法将大花杓兰内生真菌鉴定为18 个分类单元，分布在7纲9目11科16属。北京大花杓兰内生真菌包括12个属，内生真菌的多样性指数H＝1．39、D＝0．96，优势菌群为毛壳菌属（Chaetomium）和茎点霉属（Phoma）真菌，分别占总菌株数的15．25％和8．47％；吉林大花杓兰样品内生真菌归于9个属，内生真菌的多样性指数H＝1．31、D＝0．93，以毛壳菌属（Chaetomium）为优势菌群，占总菌株数的23．73％。由此可见，北京大花杓兰中内生真菌多样性高于吉林大花杓兰。
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关键词 ：大花杓兰（Cypripedium macranthum Sw．）；内生真菌；分离；鉴定；多样性
中图分类号：Q939．5 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）06－1357-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.019
Diversity of Endophytic Fungi in Cypripedium macranthum
HOU Xiao－qiang， FU Ya－juan， YUAN Jian－ping， WU Zhi－yan， WANG Li－ran， LI Wei
（College of Life science， Langfang Teachers University/Edible and Medicinal Fungi Research and Development Center of Hebei Universities， Langfang 065000， Hebei， China）
Abstract： The composition and diversity of endophytic fungal taxa in Cypripedium macranthum Sw was analyzed． The results showed that a total of 59 fungal strains were isolated from C． macranthum． These fungi were belonged to 18 taxa containing 7 classes， 9 orders， 11 families and 16 generas with analyzing ITS－rDNA sequence． Endophytic fungal groups in Beijing C． Macranthum included to 12 generas， with the diversity index H of 1．39 and D of 0．96． Chaetomium（15．25％） and Phoma （8．47％） were two major fungal groups． Endophytic fungal groups in Jilin C． Macranthum included 9 generas， with the diversity index H of 1．31 and D of 0．93．Chaetomium belonged to the core group（23．73％）． Diversity of endophytic fungi in Beijing C． Macranthum was higher than that of Jilin C． Macranthum．
Key words：Cypripedium macranthum； endophytic fungi； isolation； identification； diversity
收稿日期：2014－12－16
基金项目：国家自然科学基金项目（31100314）；河北省自然科学基金项目（C2012408007）；河北省遗传学重点发展学科建设项目；廊坊师范学院
微生物学重点学科项目
作者简介：侯晓强（1979－），男，河北怀来人，副教授，博士，主要从事药用植物菌根生物学研究，（电话）0316－2197013（电子信箱）xqhou1979@126．com。
大花杓兰（Cypripedium macranthum Sw．）为兰科杓兰属植物，其花大而艳丽，不仅是名贵的观赏花卉，还是濒危紧缺的药用植物，对全身浮肿、小便不利、风湿性腰腿痛、带下及跌打损伤等具有治疗作用［1］，疗效确切，经济价值很高。由于该植物的生态环境遭到严重破坏，资源几近枯竭。大花杓兰的繁殖率很低，虽可以产生大量的成熟种子，但因不含胚乳，自然条件下极难萌发。研究表明，几乎所有兰科植物均与真菌形成共生关系，很多内生真菌能促进兰科植物的种子萌发，加快植株的生长，提高繁殖率，增加宿主抗逆性，产生许多药用成分和新化合物等。通过对大花杓兰内生真菌的多样性进行研究，以期更加深入地了解大花杓兰与内生真菌的共生关系，为利用内生真菌促进大花杓兰种子萌发和生长，实现大花杓兰的快速繁殖提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 试验材料
供试材料为大花杓兰，分别采自北京市房山区百花山和吉林省通化县富江乡。
1．2 培养基
所用培养基为PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂12 g，去离子水1 000 mL）。
1．3 方法
1．3．1 内生真菌的分离 随机选取大花杓兰健康的根、茎、叶，用清水洗净，切成1 cm左右小段。采用体积分数为70％的乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗，3％ 次氯酸钠浸泡消毒，根、茎、叶消毒时间分别为2 min、4 min、1 min。无菌条件下，将材料剪成0．2 cm小段，置于PDA培养基上，25 ℃暗培养。待组织长出真菌菌丝，挑取菌丝先端接种至PDA斜面培养基上，25 ℃暗培养完成后，4 ℃保藏。
1．3．2 内生真菌的纯化 将PDA斜面培养基保藏的内生真菌接种至PDA平板培养基上，25 ℃暗培养6～7 d，根据内生真菌的菌落形态及显微形态特征，合并形态一致的菌株。
1．3．4 大花杓兰内生真菌多样性分析 度量在一个特定的植物组织样品中内生真菌的丰度，采用分离频率和多样性指数等指标［7，8］。分离频率可以反映出某种真菌在植物中出现的频率，多样性指数反映每种植物内生真菌的物种多样性程度。
分离频率（isolation frequency，IF）：分离到的某一指定类型内生真菌的菌株数占分离内生真菌总菌株数的百分率。
Shannon－Wiener 多样性指数（H），H＝－Σ（Pi）（lnPi）；Simpson多样性指数（D），D＝1－Σ（Pi）2，式中Pi为给定的菌种i的菌株数量占真菌总数量的比例。
采用Sorenson（Cs）相似性系数比较两地之间内生真菌种类组成的相似程度。Cs＝2j/（a＋b），式中，j为两个样地共有种数或属数；a和b分别为样地A和样地B的物种数或属数。
2 结果与分析
2．1 内生真菌的分离与鉴定
从大花杓兰材料中共分离出59株内生真菌，对各菌株及与其ITS序列相似性大于95％的已知真菌的ITS序列进行BLAST分析，构建最大邻接树，获得与待测菌株聚在同一分支且相似性最大的已知真菌。根据序列相似性原则［9］，进行菌种的鉴定，若相似性≥99％，可鉴定到种；相似性为95％～99％，可鉴定到属；相似性＜95％，可鉴定到科。59株内生真菌中57株分别归于16个属，有1株内生真菌只能鉴定到纲，为粪壳菌纲（Sordariomycetes）真菌，另有1株内生真菌只能鉴定到科，为肉座菌科（Hypocreaceae）真菌。其中，毛壳菌属（Chaetomium）和茎点霉属（Phoma）真菌为优势菌群，分别占总菌株数的38．98％和10．17％（表1）。
2．2 内生真菌的分布
2．2．1 不同器官内生真菌的分布 不同地区的大花杓兰不同器官内生真菌的数量具有一定差异，北京百花山大花杓兰共分离出28株内生真菌，其中根中分离出18株，茎中分离出7株，叶片中分离出3株。吉林通化大花杓兰共分离出31株真菌，其中根中分离出23株，茎中分离出5株，叶片中分离出3株。由此可见，大花杓兰根中内生真菌的数量高于其他部位，而叶中的数量最少。
2．2．2 不同地区大花杓兰内生真菌的分布 北京大花杓兰样品内生真菌的种类比吉林大花杓兰样品多，北京大花杓兰内生真菌归属于12 个属和1个科，优势菌群为毛壳菌属和茎点霉属真菌，分别占总菌株数的15．25％和8．47％；吉林大花杓兰样品内生真菌归属于9个属和1个纲，以毛壳菌属为优势菌群，占总菌株数的23．73％（表1）。有5个属的真菌均在两地的大花杓兰中出现，两个样地内生真菌组成相似性系数Cs＝0．43，说明北京和吉林两地大花杓兰内生真菌组成具有一定的相似性。
2．3 大花杓兰内生真菌多样性
多样性指数主要与内生真菌的种类数量和个体分配的均匀性有关。北京大花杓兰内生真菌的Shannon－Wiener 多样性指数H＝1．39，Simpson多样性指数D＝0．96；吉林大花杓兰内生真菌的Shannon－Wiener 多样性指数H＝1．31，Simpson多样性指数D＝0．93；两地大花杓兰内生真菌的多样性存在差异，北京大花杓兰内生真菌的多样性略高于吉林大花杓兰内生真菌。
3 小结与讨论
植物内生真菌的分离多采用组织分离法，即将表面消毒后的植物组织置于培养基上培养，继而分离内生真菌，根据宏微观形态特征和分子生物学方法鉴定菌种，进行多样性分析。任何一种培养基均具有选择性，不能将植物组织中所有内生真菌分离出来，这也是植物内生真菌研究的困境［10］，采用宏基因组测序分析法能更好体现植物组织中内生真菌的种类，但不能将内生真菌分离出来，所以组织分离法尚为当前获得植物内生真菌的主要方法。
本研究采用组织分离法从大花杓兰植株中分离得到内生真菌59株，利用ITS－rDNA序列分子鉴定的方法将其鉴定为18个分类单元，分布在7个纲9个目11科16个属，优势菌群为毛壳菌属（Chaetomium）和茎点霉属（Phoma）真菌。乔元宝［11］在扁脉杓兰内生真菌多样性研究中也发现扁脉杓兰中有毛壳菌属、丛赤壳属、镰孢菌属、链格孢属、小鬼伞属和木霉属真菌的存在。张亚平［12］从大花杓兰根中也分离得到毛壳菌属、枝孢菌属、光黑壳属、Leptodontidium、镰孢菌属、木霉属、青霉属真菌，从山西杓兰根中同样分离到了Leptodontidium和毛壳菌属真菌，在紫点杓兰根中亦获得Leptodontidium属真菌。除上述类群的真菌外，杓兰属植物内生真菌还涉及到另外20个属的真菌［11，12］，可见杓兰属植物内生真菌存在丰富的多样性。
大花杓兰不同器官内生真菌的数量存在一定的差异，根中分离到的内生真菌较茎和叶中多，叶中最少，可能与大花杓兰为多年生草本植物有关。北京大花杓兰和吉林大花杓兰中只有5个属的真菌同时存在，两采样地的大花杓兰内生真菌多样性存在差异，与张亚平［12］分离得到的大花杓兰内生真菌的类群同样存在差异，可见同一种植物在不同生境下具有不同的内生真菌群落组成，其多样性受生境影响较大。这一点与Pecoraro等［13］对兰科石豆兰属植物内生真菌的研究结果相似。
植物中蕴藏着丰富的内生真菌，内生真菌在植物中的分布受组织、年龄结构、生境等因素的影响， 其多样性的研究往往受到内生真菌分离方法的制约。因此，在随后的兰科植物内生真菌研究中，应综合考虑这些因素，全面调查兰科植物内生真菌多样性，获得大量的内生真菌资源，为进一步寻找兰科植物促生真菌以及筛选内生真菌来源的生物活性物质奠定基础。
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参考文献：
［1］ 郭晓莉，赵建成，彭献军． 河北珍稀濒危药用植物资源研究［J］． 干旱区资源与环境，2010，24（4）：144－149．
［2］ FAGGI E，PINI G，CAMPISI E． A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissues［J］． Phytochemical Bullet，2005，9（1）：11－15．
［3］ WHITE T J， BRUNS T D， LEE S， et al． Analysis of phylogenetic relationships by amplification and direct sequencing of ribosomal RNA genes［A］． INNIS M A， GELFAND D H， SNINSKY J J， et al． PCR protocols： a guide to methods and applications［M］． New York： Academic Press，1990．315．
［4］ SNCHEZ M S， BILLS G F， ZABALGOGEAZCOA I． Diversity and structure of the fungal endophytic assemblages from two sympatric coastal grasses［J］． Fungal Divers，2008，33：87．
［5］THOMPSON J D， GIBSON T J， PLEWNIAK F， et al． The Clustal X windows interface： Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools［J］． Nucleic Acids Res，1997（4）：4876．
［6］HOU X Q， GUO S X． Interaction between a dark septate endophytic isolate from Dendrobium sp． and roots of D． nobile seedlings［J］． Journal of Integrative Plant Biology，2009，51（4）：374－381．
［7］ 于 晶，周 峰，陈 君，等． 肉苁蓉内生真菌多样性研究［J］． 中国中药杂志，2011，36（5）：542－546．
［8］ 杜少康，陈双林，林 岱，等． 银杏叶部内生真菌多样性的研究［J］． 菌物学报，2009，28（4）：504－511．
［9］ LANDEWEERT R， LEEFLANG P， KUYPER T W， et al． Molecular identification of ectomycorrhizal mycelium in soil horizons［J］． Applied and Environmental Microbiology， 2003， 69（1）：327．
［10］ HYDE K D， SOYTONG K． The fungal endophyte dilemma［J］． Fungal Diversity，2008，33：163－173．
［11］ 乔元宝． 扇脉杓兰菌根显微结构与内生真菌多样性［D］． 重庆：西南大学，2011．
［12］ 张亚平． 中国北方三种杓兰内生真菌多样性及其对原球茎生长的效应［D］． 四川雅安：四川农业大学，2013．
［13］ PECORARO L GIRLANDA， MKULL，T， et al． Analysis of fungal diversity in Orchis tridentata Scopoli［J］． Central European Journal of Biology，2012，7（5）：850－857．
