冯爱娟１，２，吴酬飞３，王江海３，邓毛程１，２
（１．广东轻工职业技术学院食品与生物工程系， 广州 ５１０３００；２．广东高校特色调味品工程技术开发中心， 广州 ５１０３００；
３．中山大学海洋学院， 广州 ５１０００６）
摘要：以毕赤酵母重组菌（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ为研究对象，进行了亚麻子发酵脱毒工艺的研究，并对重组菌的发酵培养条件进行优化。结果表明，毕赤酵母重组菌ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ发酵扩大培养的培养基最佳碳源为２．５％玉米淀粉，最佳氮源为５.0％黄豆粕。优化后的基础发酵培养基发酵条件为温度２８ ℃、转速２５０ ｒ／ｍｉｎ、发酵时间３３ ｈ、初始ｐＨ ６．５、接菌量１．５％、装液量５０ ｍＬ／２５０ ｍＬ。在此最佳发酵条件下，菌体产量为９．０×１０１０ 个／ｍＬ。
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关键词 ：毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）；发酵条件；优化
中图分类号：Ｑ８１５文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）05－1155-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.032
收稿日期：２０１４－１２－１６
基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（ＧＣＺＸ－Ｂ１１０３）；广东轻工职业技术学院校级项目（ＫＪ２０１１０７）
作者简介：冯爱娟（１９７６－），女，湖北荆门人，讲师，主要从事微生物发酵方面的研究，（电话）１３４５０２２３２９６（电子信箱）２００５１０２０３７＠ｇｄｉｔｃ．ｅｄｕ．ｃｎ；
通信作者，邓毛程，教授，博士，主要从事生物发酵、海洋微生物及表面活性剂方面的研究，（电话）１３９２４１８５４４９（电子信箱）ｄｅｎｇｍｃ＠１６３．ｃｏｍ。
亚麻子含多功能活性物质，其营养价值极高且具有多种临床应用价值。因此，亚麻子成为功能食品领域的研究热点，冷榨亚麻子油含有丰富的α－亚麻酸，是补充亚麻酸的最有效方法，因此亚麻子是一种潜在的优良油脂原材料。但亚麻子中所含的生氰糖苷存在很大毒性，大大降低了亚麻子在粮油加工业的使用范围和利用价值。目前，亚麻子的脱毒方法主要是通过物理和化学的处理方法，但这些方法存在脱毒率较低、成本较高、难以实现产业化、溶剂残留安全风险等问题，并且会影响亚麻子中的营养成分，降低了营养价值［１］。
微生物法脱毒因其作用条件温和、脱毒成本低、安全等优点［２］越来越受到生物研究领域的关注，但微生物自身代谢和繁殖产生的酶活力低，脱毒效果较差，脱除率最高为７７％［３，４］。为此，中山大学海洋学院成功构建了分泌融合表达氰化物水合酶和β－葡萄糖苷酶的基因工程菌——毕赤酵母重组菌（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ，该工程菌株具有强氰根吸收能力和高效生氰糖苷降解能力，可使生氰糖苷中的ＣＮ－高效解离成ＨＣＮ，又能将游离的ＨＣＮ作为惟一碳氮源［５］。本研究利用已经构建好的毕赤酵母重组菌ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ菌种进行发酵培养基的设计，并对其发酵条件进行优化，以期发酵产量达到工业化生产水平的要求。
１ 材料与方法
１．１ 材料
供试菌株：毕赤酵母重组菌ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ菌种，由中山大学海洋学院王江海实验室构建并保存。
培养基成分：碳源包括葡萄糖、乳糖、玉米淀粉、甘油；氮源包括蛋白胨、酵母浸膏、黄豆粕、棉子粉。
种子培养基：２％胰蛋白胨、１％酵母提取物、１．３４％ＹＮＢ（无氨基酵母氮源）、１％甘油、４×１０－５％生物素，加入缓冲溶液，１２１ ℃灭菌２０ ｍｉｎ即得到ＢＭＧＹ液体培养基。
１．２ 方法
１．２．１ 毕赤酵母重组菌种子液的培养 取活化后的酵母菌１环，接种于１５０ ｍＬ液体种子ＢＭＧＹ培养基中， 然后进行膜过滤；放入摇床，在３０ ℃，２５０ ｒ／ｍｉｎ的转速下培养２４ ｈ备用。
１．２．２ 碳源的确定 分别以葡萄糖、乳糖、玉米淀粉、甘油为碳源，保持其他培养基成分不变进行培养选择出最佳碳源。然后将最佳碳源按照２．０％、２．５％、３．０％ ３种不同比例进行培养基配制确定最佳使用比例。在培养过程中（０～４８ ｈ）每隔３ ｈ取样测定ＯＤ值（为保证数据的准确，进行１ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心，下同），绘制曲线。在曲线出现最高峰时，测定毕赤酵母重组菌的产量进行比较，选择出最适碳源及最佳比例。
１．２．３ 氮源的确定 固定碳源为２．５％玉米淀粉，分别以蛋白胨、酵母浸膏、黄豆粕、棉子粉为氮源，保持其他培养基成分不变进行培养，选择出最佳氮源。然后将最佳氮源按照３.0％、５.0％、７.0％ ３种不同比例进行培养基配制确定最佳比例。确定方法同“１．２．２”。
１．２．４ 发酵条件的优化
１）初始ｐＨ。采用确定好的基础培养基，在温度２８ ℃、转速２５０ ｒ／ｍｉｎ、发酵时间３３ ｈ、接菌量１．５％、装液量５０ ｍＬ／２５０ ｍＬ的条件下，分别测试不同初始ｐＨ（５．５、６．０、６．５、７．０、７．５）对发酵产菌量的影响，确定最佳初始ｐＨ。
２）发酵时间。采用确定好的基础培养基，在温度２８ ℃、转速２５０ ｒ／ｍｉｎ、初始ｐＨ ６．５、接菌量１．５％、装液量５０ ｍＬ／２５０ ｍＬ的条件下测试不同发酵时间（２７、３０、３３、３６、３９、４２ ｈ）对发酵产菌量的影响，确定最佳发酵时间。
３）发酵温度。采用确定好的基础培养基，在转速２５０ ｒ／ｍｉｍ、发酵时间３３ ｈ、初始ｐＨ ６．５、接菌量１．５％、装液量５０ ｍＬ／２５０ ｍＬ的条件下，测试不同发酵温度（２５、２８、３１ ℃）对发酵产菌量的影响，确定最佳发酵温度。
４）转速。采用确定好的基础培养基，在温度28 ℃发酵３３ ｈ、初始ｐＨ ６．５、接菌量１．５％、装液量５０ ｍＬ／２５０ ｍＬ的条件下，测试不同转速（１５０、２００、２５０、３００、３５０ ｒ／ｍｉｎ）对发酵产菌量的影响，确定最佳转速。
５）接菌量。采用确定好的基础培养基，在温度２８ ℃、转速２５０ ｒ／ｍｉｎ、发酵时间３３ ｈ、初始ｐＨ ６．５、装液量５０ ｍＬ／２５０ ｍＬ的条件下测试不同接菌量（１.0％、１．５％、２.0％、２．５％、３.0％）对发酵产菌量的影响，确定最佳接菌量。
６）装液量。采用确定好的基础培养基，在温度２８ ℃、转速２５０ ｒ／ｍｉｎ、发酵时间３３ ｈ、初始ｐＨ ６．５、接菌量１．５％的条件下，测试不同装液量（２５、５０、７５、１００ ｍＬ／２５０ ｍＬ）对发酵产菌量的影响，确定最佳装液量。
２ 结果与分析
２．１ 不同碳源对毕赤酵母重组菌发酵产菌量的影响
由图１可知，培养３３ ｈ时，培养基添加碳源玉米淀粉的ＯＤ值达到峰值，添加碳源甘油其ＯＤ值在培养３９ ｈ时达到峰值，添加乳糖和葡萄糖作为碳源时，二者ＯＤ值变化不明显。基于酵母菌培养时间长的特点，为了利于大规模生产，选择发酵时间不超过４８ ｈ的培养基，因此确定玉米淀粉为重组菌ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ的最佳碳源。
由图２可知，以玉米淀粉作为培养基最佳碳源，当玉米淀粉的比例为２．５％，培养时间为３３ ｈ时，培养基ＯＤ值达到峰值，而添加３．０％和２．０％的玉米淀粉其ＯＤ值分别在３６ ｈ和３９ ｈ达到最大值，之后ＯＤ值都呈下降趋势。因此，确定玉米淀粉为重组菌ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ的最佳碳源，且比例为２．５％。
２．２ 不同氮源对毕赤酵母重组菌发酵产菌量的影响
由图３可知，培养３３ ｈ时，培养基添加氮源黄豆粕的ＯＤ值达到峰值１８．６，且之后ＯＤ值的变化比较小；添加棉子粉在培养３３ ｈ时OD达到峰值６．９；添加酵母浸膏和蛋白胨作为氮源时，ＯＤ值在培养３９ ｈ分别能达到１６．８和１６．２，但是耗时比较长，所以确定黄豆粕为重组菌ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ的最佳氮源。黄豆粕作为氮源不仅有较高的产菌量，同时还能维持高效产菌一段时间，且廉价，因此黄豆粕还可以考虑作为长效氮源而利用到大规模生产中。
由图４可知，以黄豆粕作为培养最佳氮源，黄豆粕的比例为５.0％，培养时间为３３ ｈ时，培养基ＯＤ值达到峰值１８．９，之后ＯＤ值的变化比较小，这与前期试验结果一致。而添加７.0％和３.0％黄豆粕其ＯＤ值均在培养３９ ｈ达到最大值，之后其ＯＤ值呈下降趋势，因此确定黄豆粕为重组菌ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ的最佳氮源，且比例为５.0％。
２．３ 发酵条件的优化
２．３．１ 最佳发酵初始ｐＨ确定 由图５可见，培养基初始ｐＨ为５．５、７．５时，毕赤酵母重组菌发酵产菌量差别不大；初始ｐＨ为６．０、７．０时，发酵产菌量差别也不大；当培养基初始ｐＨ为６．５时，毕赤酵母重组菌发酵产菌量达到最高峰，为４．８×１０１０ 个／ｍＬ，因此确定重组菌ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ的最佳发酵初始ｐＨ为６．５。
２．３．２ 最佳发酵时间确定 由图６可见，当培养到３３ ｈ时，培养液中毕赤酵母重组菌产菌量达到最高值，为５．４×１０１０ 个／ｍＬ，之后随着发酵时间的延长，发酵产菌量趋于稳定。因此，确定重组菌ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ的最佳发酵时间为３３ ｈ。
２．３．３ 最佳发酵温度确定 从图７可以看出，当发酵温度在２８ ℃时，培养液中毕赤酵母重组菌产菌量达到最高值，为６．８×１０１０ 个／ｍＬ，随着发酵温度继续升高，产菌量呈下降趋势。因此，确定重组菌ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ的最佳发酵温度为２８ ℃。
２．３．４ 最佳转速确定 从图８可以看出，当培养过程中转速为２５０ ｒ／ｍｉｎ时，培养液中毕赤酵母重组菌产菌量达到最高值，为８．１×１０１０ 个／ｍＬ，转速太大或太小都不利于该菌体的生长繁殖。因此，选择转速为２５０ ｒ／ｍｉｎ进行菌体培养。
２．３．５ 最佳接菌量确定 由图９可见，当接菌量为１．５％时，毕赤酵母重组菌发酵产菌量达到最高峰，为８．６×１０１０ 个／ｍＬ，之后发酵产菌量随接菌量的增加而降低，确定１．５％的接菌量为最佳接菌量。
２．３．６ 最佳装液量确定 从图１０可以看出，当装液量为５０ ｍＬ／２５０ ｍＬ时，培养基发酵产菌量达到峰值，为９．０×１０１０ 个／ｍＬ，随后产菌量随装液量的增加而降低。因此，确定重组菌ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ的最佳装液量为５０ ｍＬ／２５０ ｍＬ。
３ 小结
毕赤酵母重组菌ＧＳ１１５－Ｃｈ－Ｇｌｕ进行发酵扩大培养的培养基成分为２．５％的玉米淀粉作为碳源、５％的黄豆粕作为氮源，其优化了的基础发酵培养基的发酵条件为温度２８ ℃、转速２５０ ｒ／ｍｉｎ、发酵时间３３ ｈ、初始ｐＨ ６．５、接菌量１．５％、装液量５０ ｍＬ／２５０ ｍＬ。在此最佳发酵条件下，测得培养基ＯＤ值达到３５，比其他报道［６，７］的数据增长了５左右，菌体产量为９．０×１０１０ 个／ｍＬ，为亚麻子作为食用油脂优质的原材料创造了条件。本研究中的碳源和氮源都是相对廉价的原材料，特别是黄豆粕还可以考虑作为长效氮源使用，这样更好地满足了工业规模化生产的要求。
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（责任编辑 赵 娟）
