张 丹１，陶燕铎２，谈利红１，余 保１，颜学伟１，曹纬国１
（１．重庆医科大学中医药学院，重庆 ４０００１６；２．中国科学院西北高原生物研究所，西宁 ８１００００）
摘要： 为建立渝产续断（Ｄｉｐｓａｃｕｓ ａｓｐｅｒｏｉｄｓ）多糖的最佳超声波辅助提取工艺，设计正交试验，以续断多糖的提取率为评价指标，对续断多糖的超声波辅助提取工艺参数进行考察。结果表明，最佳超声波辅助提取工艺为料液比１∶２０（ｇ∶ｍＬ），提取时间60 min，提取４次，测得续断多糖的平均提取率为７．４７２％，ＲＳＤ为２．１２％，表明续断多糖超声波辅助提取工艺稳定，质量可控。
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关键词 ： 续断（Ｄｉｐｓａｃｕｓ ａｓｐｅｒｏｉｄｓ）；多糖；正交试验；超声波辅助
中图分类号：Ｓ５６７．２３＋９；Ｒ２８４．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０２－０431－０３
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０２．０44
续断为川续断科植物川续断（Ｄｉｐｓａｃｕｓ ａｓｐｅｒｏｉｄｓ）的干燥根［１］，又名川断，具有补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏、安胎等功效，主要用于胎漏、胎动不安、滑胎、腰膝酸软、跌打损伤和骨折等症。续断化学成分研究已较为深入，且多集中于其皂苷类成分［２，３］，已有研究表明续断类药材多糖含量较高，重庆作为续断的主产区之一，目前尚未有关于重庆产续断多糖的研究报道。多糖尤其是中药多糖具有增强机体免疫功能及抗肿瘤等药理作用，因此续断药材中含量较高的多糖类成分具有潜在的研究价值。本试验以重庆产续断为原料，采用正交试验法优选续断多糖的超声波辅助提取工艺，为续断多糖的深入研究奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料与仪器
续断药材采自重庆武隆后坪乡，经重庆医科大学王刚副教授鉴定为川续断。
ＵＶ－１７５０型紫外可见分光光度计（岛津仪器有限公司）；ＨＨ－６型数显恒温水浴锅（金坛市荣华仪器制造有限公司）；ＡＬ２０４型电子分析天平（瑞士梅特勒托利多集团）；ＫＨ５２００ＤＡ型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），ＤＧＧ－９２４０Ａ型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）。
葡萄糖标准品（中国药品生物制品检定研究院提供，批号为１１０８３３），浓硫酸、正丁醇、氯仿、丙酮、无水乙醇、９５％乙醇、石油醚、纯净水等均为分析纯。
１．２ 试验方法
１．２．１ 标准品溶液的配制 室温下精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品５１．８ ｍｇ，置５０ ｍＬ容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀即得。
１．２．２ 供试品溶液的制备 称取已烘干的续断药材粉末１０ ｇ，置圆底烧瓶中加入８０ ｍＬ石油醚回流提取脱脂，共计２次，每次２ ｈ。药渣挥去溶剂后，加入８０ ｍＬ ９５％乙醇回流提取２次，每次１．５ ｈ，药渣挥去溶剂后，加水２００ ｍＬ，１００ ℃水浴提取５次，每次２ ｈ，合并提取液，浓缩并定容至１ ０００ ｍＬ，即得供试品溶液。
１．２．３ 标准曲线的制备 吸取上述标准品溶液０、０．５、１．０、２．０、４．０、５．０ ｍＬ于５０ ｍＬ容量瓶中，加去离子水稀释至刻度，得系列葡萄糖标准品溶液。各吸取０．５ ｍＬ置于１０ ｍＬ具塞试管中，再分别加入５％苯酚１．０ ｍＬ，摇匀后迅速加入浓硫酸４．０ ｍＬ，摇匀后３０ ℃水浴３０ ｍｉｎ，冰水浴冷却１５ ｍｉｎ，在４８９ ｎｍ下测定其吸光度，以吸光度Ａ为纵坐标，葡萄糖标准品浓度Ｃ为横坐标制作标准曲线［４，５］。
１．２．４ 正交试验设计［６，７］ 选定影响多糖提取率的料液比（ｇ∶ｍＬ，下同）、提取时间以及提取次数作为考察因素，以多糖提取率作为考察指标，选用Ｌ９（３４）正交表安排试验考察各因素的影响，因素与水平见表１。
２ 结果与分析
２．１ 最大吸收波长的确定
精密量取供试品溶液与标准品溶液各０．０５ ｍＬ，置５ ｍＬ容量瓶中，分别加１．０ ｍＬ去离子水、４％苯酚溶液１．０ ｍＬ，摇匀，加入浓硫酸５．０ ｍＬ，４０ ℃水浴加热１５ ｍｉｎ，置冰水浴中冷却５ ｍｉｎ，以相应的试剂为空白，同时制备供试品与标准品的未显色样品，按照紫外可见分光光度法，在２００～８００ ｎｍ范围内进行光谱扫描，续断多糖与葡萄糖样品显色后均在４８９ ｎｍ处有最大吸收，且对应未显色样品在４８９ ｎｍ处基本没有吸收，结果见图１。因此选择４８９ ｎｍ为测定波长。
２．２ 标准曲线的绘制
精密吸取上述标准品溶液０、０．５、１．０、２．０、４．０、５．０ ｍＬ于５０ ｍＬ容量瓶中，加去离子水稀释至刻度，得系列葡萄糖标准品溶液。以吸光度Ａ为纵坐标，葡萄糖标准品浓度Ｃ为横坐标进行线性回归，得到标准曲线为：Ａ＝７．８７Ｃ＋０．００４ ３６，ｒ＝０．９９９ ３，结果表明，葡萄糖浓度在０．０１０ ３６～０．１０３ ６０ ｍｇ／ｍＬ范围内线性关系良好。
２．３ 正交试验结果
以续断多糖的提取率为评价指标，筛选续断多糖的超声波辅助提取工艺，正交试验结果见表２。由表２极差分析可知，各因素的主次顺序为Ａ、Ｃ、Ｂ，最佳提取工艺为Ａ２Ｃ３Ｂ３，即用1∶20的料液比提取４次，提取时间为６０ ｍｉｎ，且续断多糖超声波辅助提取工艺中一定要控制好料液比和提取次数。分别精密称取３份续断药材，每份５０ ｇ，依据正交试验优选的最佳工艺条件提取续断多糖，结果测得续断多糖的平均提取率为７．４７２％，ＲＳＤ为２．１２％，说明该工艺稳定可行。
３ 小结与讨论
本研究通过正交试验设计，初步建立了渝产续断多糖的超声波辅助提取工艺为料液比１∶２０，提取时间为60 min，提取４次，结果测得续断多糖的平均提取率为７．４７２％，ＲＳＤ为２．１２％，表明该工艺稳定可行，为渝产续断的进一步开发利用奠定了基础。与已有研究结果［８－１０］相比，渝产续断多糖含量高于黔产续断和五鹤续断，说明续断多糖的含量产地差异性较大，重庆为续断主产区，续断质量较优。
苯酚－硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，颜色持久，在４９０ ｎｍ左右有最大吸收，采用紫外可见分光光度法测定，简单、快速、灵敏、重复性好。
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参考文献：
［１］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典一部［Ｍ］．北京：中国医药科技出版社，２０１０．
［２］ 刘 永，卫莹芳，闫 婕，等．不同产地续断中总皂苷的含量测定［Ｊ］．时珍国医国药，２００９，20（１１）：２７６７－２７６８．
［３］ 董玉琼，何晓红，钟国跃，等．正交法优选川续断的提取工艺［Ｊ］．中国中药杂志，２００７，３２（１１）：１１０７－１１０９．
［４］ 王文平，郭祀远，李 琳，等．苯酚－硫酸法测定野木瓜中多糖含量的研究［Ｊ］．食品科学，２００７，２８（４）：２７６－２７９．
［５］ 李 妍，魏建和，许旭东，等．苯酚－硫酸法定量测定桔梗多糖的研究［Ｊ］．时珍国医国药，２００９，２０（１）：５－７．
［６］ 吴 彦，魏和平．大蓟多糖提取分离及含量测定［Ｊ］．光谱实验室，２０１０，２７（１）：９８－１０１．
［７］ 李 强，谢 杨，丁宗保，等．正交设计优选黄石斛多糖提取工艺［Ｊ］．安徽农业科学，２０１０，３８（２８）：１５６０８－１５６０９．
［８］ 翟 琨，向东山，武 芸，等．五鹤续断中多糖提取工艺的研究［Ｊ］．安徽农业科学，２００７，３５（３１）：９８０７－９８０8．
［９］ 武 芸，丁 莉．五鹤续断多糖的提取及动态分布规律的研究［Ｊ］．时珍国医国药，２００９，２０（６）：１３２５－１３２６．
［１０］ 杨武德，姜 辉，郭露玫．黔产续断总皂甙和多糖含量的测定［Ｊ］．贵州农业科学，２０１１，３９（５）：７３－７４．
（责任编辑 龙小玲）
