徐晓红1,2，刘桂英1,2，宋广军1,2，吴金浩1,2，王年斌1,2
(1.辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁 大连 116023；2.辽宁省海洋环境监测总站，辽宁 大连 116023)
摘要：利用藻类在线分析仪测定了3种不同微藻（盐藻、角毛藻、金藻）的荧光值，同时采用经典方法同步测定叶绿素a浓度和细胞密度。分析结果显示，荧光值与叶绿素a浓度、细胞密度具有显著的正相关关系。因此，利用藻类在线分析仪能够反映海水中微生物量的变化，也能够反映海水中叶绿素a浓度的变化。藻类在线分析仪的应用，能够及时掌握海水中生态环境的变化，为海域自然灾害的预警提供有力的科学依据。
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关键词 ：微藻；在线监测；叶绿素a；细胞密度
微藻生物量的测定是藻类生理生态学研究中的常规测定指标，微藻的浓度对于预测有害海藻的暴发和间接测量水样中富营养化程度具有重要的作用。实验室常用分析微藻生物量的方法很多，包括干重测定法、细胞计数法、浊度法、叶绿素a含量测定法等[1]。叶绿素a含量测定法基本采用分光光度法[2]，主要是利用分光光度计测定叶绿素a的含量，采用有机溶剂丙酮作为提取溶液。细胞计数法能够反应微藻的生长情况，但是工作量大，费时费力，且重现性较差[3]。无论是细胞计数法还是叶绿素含量测定法，均操作繁琐，耗费时间长，且不适用于连续监测，不能获得海水环境监测的实时数据，而藻类在线分析仪监测是基于现场结果，能够获取实时的连续的数据，对水体中的环境状况及时作出判断，为海域灾害性事故-赤潮的预警和政府部门的综合决策提供科学的依据。
本文对藻类在线分析仪测得的叶绿素荧光值与叶绿素浓a浓度、细胞密度相关性进行研究，确定藻类在线分析仪对海域水质进行实时连续监测，能够反映出某海域生态环境变化状况，对赤潮早期预报提供有力的科学数据。
1材料与方法
1.1实验材料
选取盐藻、角毛藻、金藻作为样品溶液，由辽宁省海洋水产科学院袁成玉研究员提供；自然海水从黑石礁附近海域采集。AOM藻类在线分析仪（捷克），751型分光光度计，TDZ-WS多管架自动平衡离心机，ZYS-200E光学显微镜。
1.2实验方法
利用蒸馏水将盐藻稀释成7个浓度梯度，使叶绿素a浓度在0～200 μg/L之间，分别测定其叶绿素荧光值、细胞密度和叶绿素a的含量，对实验结果进行分析。
1.2.1叶绿素荧光值利用AOM藻类在线分析仪测定，通过流过式检测得到叶绿素荧光参数。
1.2.2细胞密度藻类样品用具5%甲醛固定保存，样品经过静置、沉淀，处理后样品使用光学显微镜采用个体计数法进行种类鉴定和数量统计，计算细胞密度。
1.2.3叶绿素a含量采用分光光度法[4]测定在一定压力下，用醋酸纤维酯微孔滤膜（孔径为0.45 μm）对100 mL的藻液过滤，加入1 mL的碳酸镁悬浮液，然后将滤膜折叠放入10 mL具塞离心管中，加入90%的丙酮10 mL，充分振荡，使其溶解均匀，放置在4 ℃冰箱内提取24 h，然后用离心机在4 500 r/min下离心10 min，提取上清液于1 cm比色皿中，在波长为664，647，630和750 nm处用分光光度计测其吸光值，采用750 nm的吸光值用以校正提取液的浊度，其中以90%丙酮溶液作为参比，按Jeffrey Humphrey 的方程式得出叶绿素a的含量。
ρchl-a＝（11.85E664-1.54E647-0?08E630）×ｖ/（V×L）
ρchl-a——样品中叶绿素a含量， μg/L
ｖ——样品提取液的体积，mL
V——藻液实际用量，L
L——测定池光程，cm
2结果与分析
2.1仪器稳定性
开启藻类在线分析仪，待仪器稳定之后，连续检测同一自然海水6次，相对标准偏差为3?73%，多次检测同一样品，相对标准偏差均在5%以下，相对标准偏差越小，说明仪器越稳定。
在波长为590 nm的条件下，分别对盐藻溶液稀释2倍和4倍的样品进行检测，其结果如图1和图2所示，表明仪器对不同浓度的盐藻有不同的信号响应。
2.2灵敏度
对蒸馏水配制的标准藻类逐级稀释，得到仪器与叶绿素a浓度（细胞密度）的最小响应值，确定藻类在线分析仪的检出限。叶绿素a含量的最小检出限浓度为30 ng/L，藻类的最小检出限为10 cells/mL。
2.3相关性分析
2.3.1微藻叶绿素荧光值与细胞密度的相关性对盐藻的叶绿素荧光值和细胞密度之间进行线性回归分析，实验结果表明，处于对数生长期的盐藻的叶绿素荧光值与细胞密度具有良好的相关性，得到直线回归方程，Y＝0.182 4 X＋255.27，相关系数为0.986 9(见图3)。
2.3.2微藻叶绿素荧光值与叶绿素a含量的相关性对盐藻的叶绿素荧光值和叶绿素a之间进行线性回归分析，实验结果表明，处于对数生长期的盐藻的叶绿素荧光值与叶绿素a含量具有良好的相关性，得到直线回归方程，Y＝104.79 X＋128.71，相关系数为0.999 1(见图4)。
2.3.3微藻叶绿素a含量与细胞密度的相关性对盐藻的叶绿素a含量和细胞密度之间进行线性回归分析，实验结果表明，处于对数生长期的盐藻的叶绿素a含量与细胞密度具有良好的相关性，得到直线回归方程，Y＝0.014 9 X＋2.155 5，相关系数为0.993 1(见图5)。
2.4野外监测
藻类在线分析仪在凌水湾的监测结果如图6所示，表明大连凌水湾水域24 h内微藻含量基本一致，变化趋势不明显。利用显微镜进行鉴定，本海域主要藻类为中肋骨条藻、圆筛藻等。
3讨论
AOM藻类在线分析仪灵敏度高，稳定性好，所测叶绿素荧光值与叶绿素a的含量具有正相关关系，与生物量具有正相关关系，能够反映某海域生物量和叶绿素的变化趋势。
藻类在线分析仪虽然能够实时监测数据，操作简单，但是由于监测原理和本身构造的缺陷，有其不足之处。首先，传感器直接检测的是海水中所有物种在蓝光（中心波长470 nm）或者红光（590 nm）的照射下发出的荧光。在一般情况下，大多数的荧光是由浮游植物中的叶绿素引起的，但是，存在于海水中并发荧光的物质均会被检测到。因此，藻类在线分析仪是对所有的荧光物质进行定量却不能定性，如果针对某个藻类产生的叶绿素，使用该仪器进行的叶绿素测定的准确度比实验室单个样品分析的准确度差。其次，如果为了获得准确的监测数据，需要定期地对传感器进行校准。如果要保证所测定的是真实存在于海水中叶绿素的成份，那么只能通过实验室萃取分析海水中叶绿素的浓度，然后用该浓度对传感器检测得到的数据进行校准。即使用实验室方法测定的样品叶绿素值对传感器进行了校正，数据也不是很准确。因此，藻类在线分析仪主要用来检测海水中叶绿素的变化趋势，掌握海洋环境整体的变化情况。
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参考文献：
[1] 沈萍萍，王朝晖，齐雨藻，等.光密度法测定微藻生物量[J].?暨南大学学报，2001,22(3): 115-119
[2] 苏正淑，张宪政.几种测定植物叶绿素含量的方法比较[J].?植物生理学通讯，1989（5）: 77-78
[3] 董正臻，董振芳，丁德文.快速测定藻类生物量的方法探讨[J].?海洋科学，2004,28(11): 1-5
[4] GB17378.7-2007，《叶绿素-a的测定 分光光度法》海洋监测规范 第7部分：近海污染生态调查和生物监测[S].北京：中国标准出版社，2007
