王春龙，董美玲，刘琪，孔亮，李伟
（大连海洋大学，辽宁大连116023）
摘要：采用柱前衍生—高效液相色谱法建立了海马中氨基酸组成的分析方法。实验中采用中性蛋白酶对海马粉进行酶解，获得的雌海马酶解液中总氨基酸的含量为52.47mg/g，雄海马酶解液中总氨基酸含量为55.93mg/g。在两种酶解液中均检测到17种氨基酸，其中有8种是人体必需氨基酸，雌、雄海马酶解液中必需氨基酸的含量分别占总氨基酸的63.3%、63.9%。
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关键词 ：柱前衍生-高效液相色谱法；海马；氨基酸
海洋面积辽阔，是生物资源最为丰富的区域。我国历代古医药专著对海洋药物均有记载和论述，早在《黄帝内经》中便有海洋生物——乌贼骨及鲍鱼汁的药用记载。随着现代科技的发展，关于以海洋天然产物为核心开展药理活性研究的学术论文数量逐年增长，同时，部分来源于海洋的活性化合物已经被开发成临床药物，因此，丰富多样的海洋天然产物已成为药物先导化合物的主要来源[1]。
海马（hippocampus）为海龙科动物，性温、味甘，归肝、肾经，是一种名贵的海洋中药。欧洲从18世纪就已经开始将海马入药。在菲律宾南部，海马用来医治哮喘，气痛。海马中含有丰富的氨基酸、蛋白质、微量元素及高碳多烯不饱和脂肪酸等活性成分[2-4]；具有抗癌作用、性激素样作用、抗疲劳作用和提高机体免疫力、提高心肌细胞的收缩功能等，有待在功能食品、医药等方面进行研究开发。
本实验首先利用中性蛋白酶对海马进行酶解，并获得相应的酶解液，然后利用柱前衍生—高效液相色谱法分别对雌、雄海马酶解液中的氨基酸组成和含量进行了分析。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
1.1.1试剂与材料海马（克氏海马）为雌雄海马，均购自大连美罗大药房；硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、氢氧化钠、硼酸溶液、冰醋酸均为分析纯；中性蛋白酶（250g，BeijingSolarbio）；乙腈（色谱纯，百灵威科技有限公司）；N，N-二甲基甲酰胺（分析纯，天津博迪化工股份有限公司）；18种氨基酸标准品，其中酪氨酸2.5mg，其余17种氨基酸各5mg；氨基酸试剂盒，包括流动相B固体组分，衍生缓冲液固体组分A，衍生缓冲液固体组分B，平衡缓冲液固体组分A，平衡缓冲液固体组分B，氨基酸衍生化溶液均购自大连依利特分析仪器有限公司；配置流动相的溶液均经过0.45μm的滤膜过滤，超声脱气。
1.1.2仪器与设备高效液相色谱系统由LC-15C泵、SPD-15C紫外可见双波长检测器、SIL-10AF自动进样器、CTO-15C柱温箱（Shimadzu，日本）组成。色谱柱（分析型I.D.4.6mm×250mm），填充EliteAAK色谱填料（大连依利特分析仪器有限公司）。溶剂过滤装置（包括过滤器和隔膜真空泵，滤膜孔径为0.45μm，天津津腾）。Milli-Q超纯水净化仪（Millipore公司，美国）。高速多功能粉碎机（上海冰都有限公司）。Pb-10型pH计（德国赛得利斯Sartorius）。TGL-16M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。
1.2海马样品的制备及溶液配制方法
在实验中，将海马按照雌、雄分别进行预处理。
将海马剪碎成块状，然后用高速粉碎机将其进一步粉碎，分别得到雌、雄海马粉末样品，并将其装入棕色广口瓶中，备用。
衍生缓冲溶液：分别准确称取1.2400g衍生缓冲液固体组分A和7.6300g衍生缓冲液固体组分B，用适量纯水溶解后转移至500mL容量瓶中，定容后备用。
平衡缓冲溶液：分别准确称取0.9100g平衡缓冲液固体组分A和3.5800g平衡缓冲液固体组分B，用适量纯水溶解后转移至250mL容量瓶中，定容后备用。
磷酸盐缓冲溶液：称取磷酸氢二钠固体6?0200g、磷酸二氢钠固体0.5000g，加1000mL纯水溶解摇匀，用pH计测其pH为7.5～7?6，备用。
海马酶解液的制备：准确称取0.5000g的海马粉末，加入配制好的磷酸盐缓冲溶液100mL，随后加入适量的中性蛋白酶，混合均匀后在水浴下反应并计时，反应完后放入100℃的水浴锅中灭酶活10min，将灭活后的酶解液冷却至室温后过0.45μm滤膜进行过滤获得酶解液样品。在4℃冰箱中保存，作为样品储备液备用。
1.3柱前衍生—液相色谱分析的条件
色谱条件：高效液相色谱分析的流动相组成由流动相A和流动相B组成，其中流动相A——乙腈-水（1：1，v/v）；流动相B——准确称取4?1000g流动相固体组分B，加950mL的纯水溶解，并用冰醋酸调pH至6.4～6.8，再加入10mLN，N-二甲基甲酰胺，最终加水定容至100mL。梯度洗脱条件——0～38min，84%～0%B。流速为1.2mL/min。柱温设置为27℃。检测波长为360nm，进样量为10μL。
样品衍生方法：移取1mL样品溶液（氨基酸标准品或海马酶解液）于5mL棕色容量瓶中，再分别加入0.5mL衍生化溶液，定容后放置在60℃水浴中避光处反应60min。反应结束后取出冷却至室温，并用平衡缓冲溶液稀释至刻度。
1.4蛋白酶酶解时间及浓度的研究
酶解时间的考察：分别准确称取0.5000g海马粉末和0.1000g中性蛋白酶放入锥形瓶中，再量取100mL磷酸盐缓冲溶液倒入锥形瓶中进行溶解，混匀后将锥形瓶放入50℃水浴下反应并计时，每隔60min取样2.0mL，在100℃下灭酶活，经0.45μm滤膜过滤和高速离心后取上清进行氨基酸分析，根据结果确定最佳酶解时间。
时间梯度为：0min、60min、120min、180min、240min、300min、360min、420min、480min。
中性蛋白酶浓度的考察：在5个锥形瓶中分别加入0.5g海马粉末，以及一定浓度梯度的中性蛋白酶再分别加入100mL磷酸盐缓冲溶液，摇匀后放入50℃水浴下反应360min，反应完后放入100℃水浴下灭酶活10min，灭酶活后冷却到室温后，将酶解液经过0.45μm滤膜过滤和高速离心后取上清进行氨基酸分析，根据结果确定最佳酶解浓度。
中性蛋白酶浓度梯度为：0.50、0.75、1.00、1?50、2.00mg/mL。
1.5氨基酸定量标准曲线的绘制
18种氨基酸标准溶液的配制：将Elite-AAK氨基酸参照品用衍生缓冲溶液定容至250mL容量瓶中，作为氨基酸标准品储备液备用。
标准曲线的绘制：分别取配置好的氨基酸标准品储备液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL置于5mL棕色容量瓶中，再分别移入0.5mL衍生化溶液，混匀后放入60℃水浴中避光反应60min。取出衍生样品冷却至室温，用平衡缓冲溶液稀释至刻度。静置15min，取10?L按1.3的色谱条件进样分析，将峰面积与浓度进行线性回归绘制标准曲线。
2结果与讨论
2.1中性蛋白酶最佳酶解时间和最佳酶浓度的确定
本次实验的中性蛋白酶的酶解条件为：温度50℃，pH为7.55，雌性海马，酶浓度1.0mg/mL。所设定的时间梯度为：0、60、120、180、240、300、360、420、480min。结果表明，中性蛋白酶酶解海马蛋白质所产生大部分氨基酸的量随时间的增加而增加，随后逐渐趋于平缓，360min以后酶解液中的总氨基酸含量趋于平衡，因此可以取360min作为反应时间。
本实验采用的中性蛋白酶反应最适pH为7.0～7.8，最适温度为45～55℃，蛋白酶活力不小于60000活力单位，所设定的蛋白酶浓度梯度为0.5、0.75、1.0、1.5、2.0mg/mL，并测定17种氨基酸浓度随中性蛋白酶浓度增加的变化。结果表明，在一定的浓度梯度下，中性蛋白酶酶解海马蛋白质产生的17种氨基酸的量先增加，然后逐渐趋于平缓。当中性蛋白酶的浓度大于1.00mg/mL时，总的氨基酸含量的增加趋于平缓，因此，在一定条件下当中性蛋白酶的较佳浓度为1.0mg/mL。
2.2海马中氨基酸含量的测定
2.2.1氨基酸标准曲线的绘制和精密度分析将配置好的氨基酸标准品储备液稀释成一系列标准溶液，浓度范围为0～12.0μg/mL，并按照1.3的色谱条件进行色谱定量分析，以锋面积对浓度进行线性回归，获得工作曲线方程见表1。
其实验结果表明：在氨基酸的定量范围为0～12μg/mL，线性良好；以基线噪声3倍计算的方法得到的最低检出限分别为：天冬氨酸（Asp）：0.2406μg/mL，谷氨酸（Glu）：0.4125μg/mL，丝氨酸（Ser）：0.3417μg/mL，精氨酸（Arg）0?3155μg/mL，甘氨酸（Gly）：0.0514μg/mL，苏氨酸（Thr）：0.2106μg/mL，脯氨酸（Pro）：0?2581μg/mL，丙氨酸（Ala）：0.1709μg/mL，缬氨酸（Val）：0.2900μg/mL，蛋氨酸（Met）：0?3386μg/mL，半胱氨酸（Cys）：0.3298μg/mL，异亮氨酸（Ile）：0?3681μg/mL，亮氨酸（Leu）：0?2484μg/mL，色氨酸（Trp）：0.5519μg/mL，苯丙氨酸（Phe）：0?6092μg/mL，组氨酸（His）：0.5054μg/mL，赖氨酸（Lys）：0.9618μg/mL，酪氨酸（Tyr）：0?7789μg/mL。线性回归方程、相关系数及检出限如表1所示。
由表1可以看出，本实验中测定的氨基酸回归方程具有良好的线性关系，其中的R2均大于0.99。同时对所测定的各组分峰面积进行精密度分析，从表1中可看出，除了缬氨酸在2.0μg/mL、异亮氨酸在6.0μg/mL时的精密度因谱图基线噪声影响而引起RSD增大外，其它浓度下计算得到的精密度RSD值均小于5%。因此，本实验中建立的用于分析海马酶解液中各种氨基酸含量的标准曲线符合定量要求，数据可靠性较好，可以使用该回归方程直接用于氨基酸含量的分析。
2.2.2海马氨基酸的定性分析在一定的色谱条件下分别取标准溶液和海马中性蛋白酶酶解液样品溶液进行色谱分析，结果见图1。
1.Asp，2.Glu，3.Ser，4.Arg，5.Gly，6.Thr，7.Pro，
8.Ala，9.Val，10.Met，11.Cys，12.Ile，13.Leu，
14.Trp，15.Phe，16.His，17.Lys，18.Tyr
从图中可以看出，海马的中性蛋白酶酶解液中的17个色谱峰（谱图A）与氨基酸标准品中的17种氨基酸的保留时间一致，因此可以确定海马体内含有17种氨基酸，分别确定了海马酶解液中含有天冬氨酸（Asp）、谷氨酸Glu）、丝氨酸（Ser）、精氨酸Arg）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）、赖氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）。在酶解液中没有检测到半胱氨酸，可能是因为使用的是酶水解，条件温和，半胱氨酸中有二硫键，酶水解不能使二硫键断开，所以没有检测到半胱氨酸。其中脯氨酸和色氨酸的含量较少，峰面积较小。而在酶解液中的17种氨基酸中包括人体必需的八种氨基酸（缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、赖氨酸）。
2.2.3海马中氨基酸含量的定量分析用中性蛋白酶对雌、雄海马蛋白质分别进行酶解，在1.3的色谱条件下进样分析，得到的峰面积后经计算得到中性蛋白酶酶解液中17种氨基酸的含量如表2所示。
结果表明，在雌、雄海马的酶解液中均含有人体所含的八种必需氨基酸为缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、赖氨酸，这八种氨基酸在人体不能通过转化获得，只能通过食物提供。经过计算可知，在相应的酶解液中，雄海马中氨基酸浓度为55.93μg/mL，雌海马中氨基酸浓度为52.47μg/mL。
通过下式可以推算海马中17种氨基酸所占干重的含量如表3所示。
计算公式：氨基酸含量（mg/g）＝氨基酸浓度（mg/mL）×稀释倍数（5）×缓冲溶液体积（100mL）÷海马干重（0.5g）
如果蛋白质中所含氨基酸的种类及比例愈接近人体需要，则蛋白质的质量越高，称为优质蛋白质。分析结果表明，海马酶解液中所含的17种氨基酸均是人体所需要的，雄海马中必需氨基酸的含量达到总氨基酸含量的63.9%，雌海马中必需氨基酸的含量达到总氨基酸含量的63.4%。蛋白质营养价值的高低决定因素有：①必需氨基酸的含量；②必需氨基酸的种类；③必需氨基酸的比例。综合以上分析，可得知海马体内必需氨基酸的含量较高，其生理活性可能与氨基酸含量高有关。
表3雌、雄海马中17种氨基酸的含量（占海马干重）
3结论
本论文建立了对海马中氨基酸组成进行定性定量分析的柱前衍生—高效液相色谱分析方法，该方法具有快速准确的特点。分析结果表明，海马经过中性蛋白酶酶解后，雌海马酶解液中的总氨基酸含量为52.47mg/g，雄海马酶解液中总氨基酸含量为55.93mg/g。在酶解液中检测到的17中氨基酸中含有人体所需要的8种必需氨基酸，酶解液中雌、雄海马中必需氨基酸的含量分别达到总氨基酸含量的63.3%，63.9%。
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参考文献：
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