崔安妮１，２，姜 鑫１，２，郑毅帆１，２，王 欢１，２
（１．沈阳工学院 辽宁 抚顺 １１３１２２；２．沈阳农业大学 沈阳 １１０８６６）
摘要：利用从全国采集的土样中收集到的２８个品系的昆虫病原线虫，分离并筛选出２８株高毒力共生菌株，对高毒力菌株的毒素进行初步提取，利用水稻恶苗病菌进行抑菌活性测定，结果表明，共生菌ＮＣ３４－３Ｂ的毒素对水稻恶苗病菌抑菌活性最高，抑菌圈半径为１７．５０ ｍｍ。
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关键词 ：昆虫病原线虫共生菌；毒素；抑菌活性
中图分类号： Ｓ４３５．１１１ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０４－０８６２－０２
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０４．０２２
收稿日期：２０１４－１１－１５
基金项目：国家自然科学基金项目（３１３０１６６３）；辽宁省教育厅项目（Ｌ２０１２２４７）；农业部公益性行业项目（２００８０３００１）；辽宁省大学生创新训练项目；沈阳工学院大学生创新训练项目
作者简介：崔安妮（１９９２－），女，辽宁沈阳人，在读硕士研究生，研究方向为生物防治，（电话）１８２４２３２５１６４（电子信箱）923060729@qq.com；通讯作者，
王 欢（1977-），女，辽宁沈阳人，主要从事生物技术研究，（电话）13654011667（电子信箱）ｚａｎｈｕａｎ＠１６３．ｃｏｍ。
农业是其他生产的基础，关系到人类的生存问题，而农业中的关键问题之一就是病虫害的防治。随着可持续发展思想的出台，生物防治成为各国研究的重点。昆虫病原线虫共生菌以其杀虫迅速、对人畜安全、寄主范围广、抗逆性强等优点，引起国际高度重视。随着对昆虫病原线虫共生菌研究的不断深入，共生细菌的多种生物学功能陆续被发现，其次生代谢产物具有杀虫、抑菌、抗肿瘤和杀线虫等多种生物活性，是一类新型的具有开发潜力和应用前景的生物资源［１－５］。本研究初步分离了共生菌的代谢产物，通过生物测定对不同品系昆虫病原线虫共生菌毒素的抑菌活性进行评价，为共生菌的开发利用提供基础数据和试验方法，为进一步深入研究共生菌抑菌活性提供物质基础，为开发新的生物杀菌剂提供新材料。
１ 材料与方法
１．１ 材料
供试真菌：水稻恶苗病菌。
供试昆虫：大蜡螟幼虫（Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）。
供试试剂：碱性ＥＤＴＡ溶液（NaHCO3 １０ ｇ／Ｌ；ＥＤＴＡ １ ｍｍｏｌ／Ｌ；ｐＨ ８．０）；透析袋（国产２７．７ ｍｍ，透析相对分子质量１２ ０００～１４ ０００ Ｄ）。
供试培养基：牛肉汤培养基；NA培养基；ＰＤＡ培养基；鉴别培养基。
供试线虫品系：Ａ２４，ＨＺ，ＮＣ３４，Ｏｔｉｏ，１５－２，Ｈｔ１，１，２，ＳＹ５，８，０３１００Ｃ，０３１０１Ｙ，０３１２１Ｈ，０３１２－４，０３２１－２，０３５５ＢＣ，０３５５ＤＪ，０３５６Ｈ，０３６１Ｄ，０３６２Ｗ，０３８４Ｑ，０３８５Ｄ，０３８６Ｌ，０３８９，０３９６Ｙ，０３９７Ｃ２，０３９８Ｂ，０３９９Ｈ。
１．２ 方法
１．２．１ 共生菌的分离 用昆虫病原线虫感染健康的大蜡螟５龄幼虫，虫体死亡后对其表面消毒，将其体液接种于鉴别培养基（ＮＢＴＡ）２８ ℃恒温箱中培养［６］，待平板上出现单菌落时，观察菌落颜色，蓝色为Ｉ型菌，红色为ＩＩ型菌［７］，挑取单菌落于ＮＢＴＡ平板上划线纯化一次，再挑取单菌落转接于ＮＡ斜面培养基，放于２８ ℃恒温箱中培养后，放到冰箱中４ ℃保存［８］。
１．２．２ 透析袋的处理 在碱性ＥＤＴＡ溶液中将透析袋煮沸１５ ｍｉｎ，用去离子水彻底清洗；然后放在１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）中再煮沸１５ ｍｉｎ，冷却后，存放于４ ℃备用。
１．２．３ 共生菌毒素的初步提取 将菌株分别接入牛肉汤培养基中，１６０ ｒ／ｍｉｎ、２８ ℃振荡培养４８ ｈ，制成发酵液后，在冷冻离心机中（４ ℃，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ）离心１５ ｍｉｎ，取其上清液，加入饱和硫酸铵至８５％，４ ℃静置过夜，再于冷冻离心机中离心１０ ｍｉｎ，取其沉淀用少量去离子水溶解，在去离子水中透析４８ ｈ，期间多次更换去离子水，彻底去除溶液中的硫酸铵，再将菌液放入冷冻干燥机中冷冻干燥４８ ｈ，所得干粉即毒素的粗提物，于－２０ ℃保存，备用。生物测定时将毒素溶于去离子水中配成５ ｍｇ／ｍＬ即为供试样品。
１．２．４ 共生菌毒素对水稻恶苗病菌的抑菌试验 将灭菌后的直径为６ ｍｍ的小圆滤纸片在供试样中浸润５ ｍｉｎ后，放入ＰＤＡ培养基平板中心，将水稻小斑菌分４块放在滤纸片的四周，距培养皿边沿２ ｃｍ 处。每平板为１个重复，每处理设３个重复，设置去离子水为对照，放置于２７ ℃恒温培养箱中培养，５ ｄ后测量抑菌圈大小，对各数据用ＳＰＳＳ１７版统计分析软件进行单因素方差分析。
２ 结果与分析
由表１可知，２８个品系共生菌菌株的毒素对水稻恶苗病菌均有抑菌活性。经ＳＰＳＳ分析，共生菌ＮＣ３４-3B毒素的抑菌活性最高，对水稻恶苗的抑菌圈半径为１７．５０ ｍｍ，而抑菌圈半径与ＮＣ３４－３Ｂ无显著差异的菌株为Ａ２４-6R、１５－２－１Ｒ、Ｈｔ１－１Ｒ、１－１Ｒ、２－２Ｒ、ＳＹ５－５Ｂ、０３２１－２－１Ｂ、０３５５ＢＣ－１Ｂ、０３５５ＤＪ－３Ｒ、０３６２Ｗ－１Ｂ、０３８９－２Ｒ、０３９７Ｃ２－１Ｂ、０３９８Ｂ－２Ｒ，抑菌圈半径分别为１５．１７、１５．００、１５．７０、１５．８３、１６．５０、１５．６７、１６．３３、１５．６７、１５．６７、１６．００、１７．００、１６．１７、１５．１７ ｍｍ；共生菌８－３Ｂ毒素的抑菌活性最低，对水稻恶苗的抑菌圈半径仅为１１．８３ ｍｍ，而抑菌圈半径与８－３Ｂ无显著差异的菌株为Ｏｔｉｏ－２Ｒ、ＨＺ－２Ｒ、０３１００Ｃ－２Ｒ、０３１０１Ｙ－２Ｒ、０３１２１Ｈ－３Ｂ、０３５６Ｈ－２Ｒ、０３６１Ｄ－２Ｒ、０３８４Q－１Ｒ、０３８５Ｄ－１Ｂ、０３８６Ｌ－３Ｂ、０３９６Ｙ－５Ｂ，抑菌圈的平均半径分别为１４．１７、１４．００、１３．８３、１２．６７、１２．３３、１２．５０、１３．６７、１４．１７、１２．３３、１３．００、１３．３３ ｍｍ。
３ 小结与讨论
水稻是人类的主要粮食作物之一，总产量占世界粮食作物产量第三位，水稻恶苗病菌是水稻的主要病害之一，严重时可造成减产４０％～５０％［９］，在化学防治引起的环境问题日益被关注的今天，寻找植物源、生物源和安全高效的杀菌剂已受到了世界各国的广泛重视。昆虫病原线虫共生菌是一类特殊的革兰氏阴性细菌，能够产生抑菌物质是昆虫病原线虫共生菌的普遍特征［１０］，本研究以我国本土采集分离得到的共生菌为材料，利用生物测定对２８个昆虫病原线虫共生菌品系毒素的抑菌活性进行了评价，其中共生菌ＮＣ３４－３Ｂ毒素的抑菌效果最好。
早在１９５９年，就有学者发现昆虫病原线虫共生细菌能分泌一种具有抑菌活性的物质，这种物质可以防止被线虫侵染的昆虫尸体腐烂，在线虫完成生活史方面起到了重要作用。本课题组前期也进行了共生菌发酵液对水稻恶苗的抑菌活性测定［１１］，结合本研究结果，发现利用硫酸铵沉淀法提取毒素，得到的毒素的抑菌活性高于发酵液的抑菌活性，但高毒力菌株抑菌活性差别不大。同时发现不同线虫品系共生菌毒素的抑菌活性不尽相同，共生菌代谢产物与发酵液的抑菌活性也有一定差异，因此，有必要对其所产生的抑菌活性物质做进一步鉴定，以期发现新的抑菌活性物质，为研制和开发拥有我国自主知识产权、高效安全而又具实用价值的生物农药新品种提供新材料，为加速发展我国的生物农药产业进程提供新途径和新方法。
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（责任编辑 龙小玲）
