陆 宁１，任学良１，汪汉成１，王 进２，王 轶１，王仁刚１，王茂胜１
（１． 贵州省烟草科学研究院烟草行业分子遗传重点实验室，贵阳 ５５００８１；２．长江大学生命科学学院，湖北 荆州 ４３４０２５）
摘要：采用十二孔板法、培养皿小苗法、注射接菌法及菌液灌根法，以病情指数和烟苗危害症状为主要评价指标，对贵州省１２个烤烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）品种（系）进行抗烤烟青枯病［Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ （Ｓｍｉｔｈ） Ｙａｂｕｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ］鉴定和评价。结果表明，十二孔板法和培养皿小苗法不能反映烤烟的真实抗性，注射接菌法对试验操作要求较高，菌液灌根法鉴定结果较为准确。所测１２个品种（系）中达到高抗水平的有贵烟１号、贵烟１４号和抵字１０１，中抗水平的有Ｋ３４６、Ｋ３２６、岩烟９７、贵烟６号、贵烟８号和贵烟９号，敏感水平的有红花大金元、长脖黄和南江３号。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ：烤烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）；烤烟青枯病［Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ （Ｓｍｉｔｈ） Ｙａｂｕｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ］；抗病鉴定
中图分类号：S435.72 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０４－０８６４－０４
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０４．０２３
收稿日期：２０１４－０５－２９
基金项目：贵州省科技厅农业攻关项目（黔科合ＮＹ字［２０１１］３０４７）；中国烟草总公司重点项目（中烟办［２０１０］２２１）；中国烟草总公司重大专项（中烟办［２０１３］１５９）；贵州省优秀青年科技人才培养对象专项资金（黔科合人字［２０１３］０２）
作者简介：陆 宁（１９７８－），男，云南文山人，助理研究员，主要从事烟草病虫防治研究工作，（电话）１３８８５０５００８６（电子信箱）ｌｕ＿ｎｉｎｇ＠１２６．ｃｏｍ；
通信作者，王茂胜，副研究员，主要从事烟草微生物研究工作，（电子信箱）ｗａｎｇｍａｏｓｈｅｎｇ９８０１＠１６３．ｃｏｍ。
由茄科雷尔氏菌［Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ （Ｓｍｉｔｈ） Ｙａｂｕｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ］引起的烤烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）青枯病是一种世界性土传细菌性病害，极具破坏性［１－３］。该病害１８６４年在印度尼西亚对烤烟造成了毁灭性危害，此后，迅速扩展至主要产烟国家并成为制约烤烟生产的主要病害［４］。烤烟青枯病在中国主要产烟省区普遍发生。近年来，由于气候等方面的原因，该病害在中国的危害范围逐步扩大［５］。长期的连作使烤烟土传青枯病越来越严重，通常导致烟叶质量下降、减产甚至绝收，烟农经济利益受损，并影响卷烟工业的发展［６－８］。
烤烟青枯病是典型的维管束病害，烤烟根、茎、叶各部位均可被侵染，主要危害植物的根和茎，病株侧根常变黑腐烂，茎部可见黑色条斑，叶片单边萎蔫、过早变黄，在通常情况下，叶片及其相连的茎部枯萎后仍呈绿色［９］。目前，烤烟青枯病的防治方法主要有选育抗病品种、农业防治、化学防治及生物防治。然而，迄今尚无理想的抗性品种；农业防治方面主要依赖轮作，但防效有限；化学防治依赖农用硫酸链霉素，容易使病原菌产生抗药性，引起环境污染和农药残留等问题，迄今还未发现特效的杀菌剂。培育和应用抗病品种是目前防治青枯病最有效的途径。而对烤烟品种（系）抗病性的快速鉴定则是抗病育种中较为关键的环节，快速鉴定方法的选择尤为重要。目前对烤烟抗青枯病的鉴定方法按生育期可分为苗期鉴定和田间鉴定［１０］，田间鉴定需要自然发病的田块，每个品种（系）２次以上重复，若备选品种（系）较多则不能满足快速筛选的需要。而苗期鉴定有节约成本、快速、能够大批量筛选等优点。已有报道的苗期鉴定方法有叶片注射接种、茎部穿刺接种、伤根灌菌液接种、印迹法、ＷＦＴ法等［１１，１２］。方法较多，但各种方法在同一条件下进行比较的研究报道鲜见。本试验以已知抗性品种（系）为对照材料，对不同品种（系）进行青枯病抗病性鉴定，以期找到一种有效的鉴定方法，为烤烟抗病品种（系）的鉴定提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 烤烟材料
供试烤烟品种（系）共计１２份，均由贵州省烟草科学研究院育种工程技术中心提供，其中感病材料有红花大金元、长脖黄、南江３号；抗性材料有Ｋ３４６、抵字１０１、岩烟９７和Ｋ３２６；待测材料有贵烟１号、贵烟６号、贵烟８号、Ｙ－１１和Ｙ－５。所有材料种子按照常规方法播种于漂浮育苗盘（１６０孔／盘）、含有无菌蛭石的１２孔细胞培养板（美国Ｃｏｒｎｉｎｇ公司）、铺有用无菌水保湿滤纸的培养皿（直径９０ ｍｍ）中。漂浮育苗盘烟苗置于１５～２８ ℃和自然光照条件下培养，并按照标准育苗规程进行管理；细胞培养板和培养皿均置于２５ ℃、相对湿度大于８０％、１６ ｈ光照８ ｈ黑暗交替条件下。
１．２ 供试菌株
供试菌株为烟草青枯病菌，由贵州省烟草科学研究院微生物学实验室提供，鉴定为１号小种、生化型Ⅲ，为贵州省烤烟产区烤烟青枯病菌优势小种。采用茄科劳尔氏菌选择培养基（ＳＭＳＡ）和牛肉膏蛋白胨培养基（ＮＡ和ＮＢ）对烤烟青枯病菌进行培养。
１．３ 烤烟青枯病抗性鉴定
１．３．１ 注射法 参照文献［１３－１５］的方法，采用温室苗期叶片人工注射接种法进行注射接菌。将漂浮育苗盘中４叶期的烟苗移至塑料杯中培养，待烟苗长至７～８片叶时用微量注射器（１０ μＬ）将制备好的菌悬液从近侧脉处注入叶片的上下表皮之间（针头和叶面夹角８～１０°），同时注射至烟苗第三片叶（叶位从下向上）与茎的交界处的木质部内，以注射无菌ＮＢ液体培养基为对照，置于温室内，定期观察记载叶片和茎部注射区的变化。每品种（系）接种１２株，接种３０ ｄ后考察烤烟品种（系）抗性。根据病情指数（病指ＤＩ）对烤烟品种（系）的青枯病抗性进行分级［１６］，标准见表１。
１．３．２ 十二孔板法鉴定 参照文献［１７］的方法，将不同烤烟品种（系）播种于十二孔细胞培养板对应孔中，待烟苗长至４~６片叶时用移液器将５００ μＬ的青枯病菌菌液（1×１０８ ＣＦＵ／ｍＬ）加入十二孔细胞培养板的孔中，接菌后将烟苗置于３０ ℃、１３ ｈ光照１１ ｈ黑暗交替条件下培养，２０ ｄ后调查烟苗的发病率和病情指数［１３］。抗性鉴定同“１．３．１”。
１．３．３ 培养皿小苗法 待培养皿烟苗长至４叶期时，用无菌棉签蘸取ＮＡ培养基表面的青枯病菌，无菌水将其稀释成１×１０８ ＣＦＵ/mL的菌悬液，每培养皿烟苗接菌０．５ ｍL的菌悬液，以接种同体积无菌水处理作为对照，每处理接种２０株烟苗。接菌后将烟苗置于３０ ℃、１３ ｈ光照和１１ ｈ黑暗交替条件下培养，２０ ｄ后调查烟苗的发病率和病情指数［１８］。抗性鉴定同“１．３．１”。
１．３．４ 菌液灌根法 将漂浮育苗盘４叶期的烟苗移至塑料杯中培养，待烟苗长至７～８叶期时，每株烟苗灌溉５０ ｍＬ １×１０８ ＣＦＵ／ｍＬ的青枯病菌菌悬液，以灌溉同体积无菌水的作为对照，每处理接种１２株烟苗。接菌后将烟苗置于１５～３０ ℃、相对湿度大于８０％的自然光照条件下培养，３０ ｄ后调查烟苗的发病情况，计算烟株的发病率、病情指数。抗性鉴定同“１．３．１”。
２ 结果与分析
２．１ 注射法抗性鉴定情况
注射法鉴定结果见图１、图２。不同品种（系）间抗性差异较大，对青枯病表现为抗的品种（系）有４个，分别为岩烟９７、抵字１０１、贵烟６号、贵烟８号，其中贵烟６号表现最好；表现中抗的有４个，为贵烟１号、Ｋ３２６、Ｋ３４６和贵烟１４号；表现感病及高感的有４个，包括贵烟９号、南江３号、红花大金元和长脖黄，这几个品种（系）发病速度较快。此外，除了Ｋ３２６和Ｋ３４６外，其余品种（系）的抗性鉴定结果与已知抗性存在一定差异，这可能与该方法对操作技术要求较高有关，注射力度及角度的不一致均影响烟株后期的发病率。
２．２ 十二孔板法和培养皿小苗法抗性鉴定情况
十二孔板法和培养皿小苗法鉴定结果见表２。２种方法的鉴定结果存在一定的差异，且鉴定结果与已知抗性也有差异，只有红花大金元、长脖黄与已知抗性较为一致，均为感病。十二孔板法的岩烟９７、培养皿小苗法的Ｋ３２６和抵字１０１与已知抗性一致外，其余均有差异，有的品种（系）差异较大，如南江３号已知抗性为感病，而鉴定结果为中抗和抗。这可能与十二孔板法、培养皿小苗法所用烟苗苗龄较小有关，较小的烟苗并不能完全发病，难以准确地反映其抗病性。可见，这２种方法并不适用于烤烟抗性材料筛选和鉴定。
２．３ 灌根法抗性鉴定情况
菌液灌根法鉴定结果见表３。鉴定结果和已知抗性对应较好。对烤烟青枯病表现高抗的品种（系）贵烟１号、抵字１０１、贵烟１４号病指均为０，抗性较强；表现中抗的有６个，为贵烟８号、贵烟９号、岩烟９７、贵烟６号、Ｋ３４６和Ｋ３２６，其中贵烟８号、贵烟９号、岩烟９７和贵烟６号的抗性要较Ｋ３４６和Ｋ３２６高；表现高感的有３个，其病指均为１００，发病较迅速且明显，分别是长脖黄、南江３号和红花大金元，而这些品种（系）的已知抗性为感病，这可能与室内接种温湿度较大有关。总体来说，菌液灌根法鉴定的抗性与已知抗性一致性较好，该方法用于抗病材料的筛选可靠度较高。
３ 小结与讨论
通过注射法、十二孔板法、培养皿小苗法、菌液灌根法对１２个烤烟品种（系）进行抗烤烟青枯病鉴定，在供试材料中，红花大金元、长脖黄、南江３号、Ｋ３４６、抵字１０１、Ｋ３２６和岩烟９７为已育成烤烟品种，结果表明４种方法的鉴定结果不一致。菌液灌根法的鉴定结果与这些品种（系）的已知抗性基本一致，注射法次之，十二孔板法和培养皿小苗法的鉴定结果与这些品种（系）的已知抗性出入较大。菌液灌根法与田间烤烟自然条件下发病诱因基本一致，所测烟苗的苗龄较大，能较好地反映烤烟品种（系）的真实抗性。而注射法对试验操作要求较高，力度较重或角度偏差都可能导致结果不同，可操作性和可重复性不强。另外，注射接种对烟苗造成伤口，可能会影响到青枯病菌的侵染和扩散，影响病原菌压力下烤烟品种（系）抗性的真实性。十二孔板法对烤烟品种（系）抗性的快速鉴定起到了一定的作用［１６］，但本试验结果表明，该方法存在误差，不能反映烤烟品种（系）的真实抗性，这也可能与烟苗苗龄及接种方法有关；培养皿小苗法也有同样的问题。综合比较４种鉴定方法，菌液灌根法能较好检测不同烤烟种质资源的抗性。
综合本试验结果可见，贵烟１号、贵烟１４号是青枯病的高抗品种（系），贵烟６号、贵烟８号和贵烟９号为中抗品种（系），此结果可供大田试验借鉴并检验。烤烟抗病育种难度大、时间长、过程复杂，需要大量引进不同抗性的烤烟种质资源进行筛选鉴定，本研究可为不同种质资源的抗性筛选提供参考。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献：
［１］ ＮＩＳＨＩ Ｔ， ＴＡＪＩＭＡ Ｔ， ＮＯＧＵＣＨＩ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｉｌｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ，２００３，１０６（４）：７６５－７７０．
［２］ ＡＬＩＳＯＮ Ｅ， ＲＯＢＥＲＴＳＯＮ Ｗ， ＰＡＴＲＩＣＫ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅ（ａｖｒＡ） ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｉｌｔ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ［Ｊ］． ＭＰＭＩ，２００４，１７（１２）：１３７６－１３８４．
［３］ ＹＩ Ｌ Ｑ， ＳＨＥＮＧ Ｘ， ＺＨＯＵ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＱＴＬｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｉｌｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ （Ｎ． ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．） ［Ｊ］． Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２０１３，１９２（２）：２５９－２６６．
［４］ ＨＡＹＷＡＲＤ Ａ Ｃ． Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｉｌｔ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ［Ｊ］． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９１，２９：６５－８７．
［５］ 孔凡玉．烟草青枯病的综合防治［Ｊ］．烟草科技，２００３（４）：４２－４３．
［６］ ＤＵＫＥＳ Ｐ Ｄ， ＡＰＰＬＥ Ｊ Ｌ． Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ｏｆ ｚｏｏｓｐｏｒｅｓ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ ｂｙ ｐｌａｎｔ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｃｅｒｔａｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， １９６１，５１（2）：１９５－１９７．
［７］ ＳＴＯＫＥＳ Ｇ Ｗ， ＬＩＴＴＯＮ Ｇ Ｃ． Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｂａｃｋ ｓｈａｎｋ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｒａｃｅｓ ０ ａｎｄ １ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９６６，５６（６）：６７８－６８０．
［８］ ＭＣＣＡＲＴＥＲ Ｓ Ｍ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｏｉｌ ｍｏｉｓｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｏｉｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｂｌａｃｋ ｓｈａｎｋ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９６７，５７（１２）：６９１－６９５．
［９］ 周训军，王 静，杨玉文，等．烤烟青枯病研究进展［Ｊ］．微生物学通报，２０１２，３９（１０）：１４７９－１４８６．
［１０］ 徐 玲．烟草青枯病抗性鉴定方法［Ｊ］．现代农业科技，２００９（１２）：１２２-124．
［１１］ 贾春燕．烟草青枯病菌的分子检测与烤烟品种抗病性研究［Ｄ］． 山东泰安：山东农业大学，２０１１．
［１２］ ＧＵＴＩ Ｅ ＲＲＥＺ Ｗ Ａ， ＭＩＬＡ Ａ Ｌ． Ａ ｒａｐｉｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｃｅｓ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ ｏｎ ｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Dｉｓｅａｓｅ，２００７，９１（８）：９８５－９８９．
［１３］ 匡传富，罗 宽．烟草品种对青枯病抗病性及抗性机制的研究［Ｊ］．湖南农业大学学报（自然科学版），２００２，２８（５）：３９５－３９８．
［１４］ 郑继法．不同品种（系）烤烟叶片对注射法接种烟草青枯病菌的反应［Ｊ］．植物保护，１９９２，１８（２）：１０－１２．
［１５］ 杨友才，周清明，朱列书．烟草品种青枯病抗病性及抗性遗传研究［Ｊ］．湖南农业大学学报（自然科学版），２００５，３１（４）：３８１－３８３．
［１６］ ＧＢ／Ｔ ２３２２４－２００８，烟草品种抗病性鉴定［Ｓ］．
［１７］ ＢＩＴＴＮＥＲ Ｒ Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｉｌｔ， ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ， ｉｎ tｏｂａｃｃｏ cｕｌｔｉｖａｒｓ［Ｄ］． Ｒａｌｅｉｇｈ： Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ２０１１．
［１８］ ＷＡＮＧ Ｈ Ｃ， ＬＩ Ｗ Ｈ， ＣＨＥＮ Ｑ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｒａｐｉｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２０１２，１０２（３）： ２６７－２７１．
（责任编辑 陈 焰）
