孙 媛１ａ，余玉莎１ａ，李梦娇１ａ，周 斌２，张芬芬１ｂ，李 玲１ａ，王继英１ａ，赵明富１ａ，文国松１ｂ
（云南农业大学，ａ．农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室；ｂ．农学与生物技术学院，昆明 ６５０２０１；
２．云南大学微生物研究所，昆明 ６５００９１）
摘要：从香料植物天竺葵上分离筛选到一株产香真菌，对该菌株进行鉴定，确定其分类地位，并克隆其产脂肪酶基因进行序列分析。结果表明，分离筛选得到的菌株ＴＺＫ－１形态为菌落圆形，质地疏松，菌丝由白色变为灰褐色，菌丝无隔膜，有假根，孢囊梗基部膨大形成球形孢子囊，孢囊孢子椭圆形；该菌株１８Ｓ ｒＤＮＡ序列与米根霉Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＫＦ７１７３７０）相应片段的核苷酸序列同源性为９９．６％。利用ＰＣＲ扩增得到脂肪酶基因，该基因编码区全长为１ １０８ ｂｐ，编码３６９个氨基酸，脂肪酶核苷酸序列与推导的氨基酸序列与Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＡＦ２２９４３５）和Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＪＮ６８９９８８）聚为一支，支持强度分别达到９２％和９５％。结合形态学初步确定，产生浓郁甜酒香味的菌株为米根霉，能产生脂肪酶，克隆其脂肪酶基因全长。
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关键词 ：真菌；筛选；脂肪酶；ＰＣＲ扩增
中图分类号：Ｓ１８８文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）05－1227-05
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．0５．０5０
收稿日期：２０１４－０８－０８
基金项目：云南省烟草公司项目“微生物菌剂在烟草病害防治中的应用研究”（２０１１ＹＮ５８）
作者简介：孙 媛（１９８８－），女，云南曲靖人，在读硕士研究生，研究方向为植物病理，（电话）１３５７７１４２０５３（电子信箱）１８３６５８７９４＠ｑｑ．ｃｏｍ；
通信作者，赵明富，副教授，主要从事植物病理和微生物研究，（电子信箱）ｚｈａｏｍｉｎｇｆｕ＠１６３．ｃｏｍ；文国松，副研究员，主要从事中药材研究，
（电子信箱）ｗｅｎｇｓ＠１６３．ｃｏｍ。
脂肪酶（Ｌｉｐａｓｅ，Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）是一类特殊的酯酶，可以在油水界面上催化长链甘油酯水解为长链脂肪酸和甘油，在非水相系统中，可以催化转酯和酯合成等多种反应［１］。通过改变反应体系的水含量便可以控制脂肪酶催化的反应方向，可以进行水解、酯合成、酯交换、转酯化等一系列反应。脂肪酶在常温常压下反应具有反应条件温和、转化率高和特异性强，不易产生副产物等特点，从而能避免化学催化带来的有害物质。因此，脂肪酶越来越多地运用于光学活性化合物和天然产物的合成，如在食品、饲料、洗涤、纺织、能源等加工业中应用广泛［２，３］，成为重要的工业酶制剂之一。脂肪酶广泛存在于植物、动物和微生物中，其中微生物脂肪酶具有种类多、底物专一性类型多、独立的脂肪酶基因易获得等优点［４］，因而微生物是脂肪酶的一个重要来源，其中根霉属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）是脂肪酶的重要生产菌［５］。根霉属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ．）是一类分布较为广泛的真菌，属于接合纲毛霉目毛霉科，分布于酒曲、植物残体、腐败有机物、动物粪便和土壤中，在传统和现代发酵工业中有着重要作用。其中与生物技术相关的根霉有匍枝根霉（Ｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）、华根霉（Ｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）［６］、德氏根霉（Ｒ． ｄｅｌｅｍａｒ）［７］和米根霉（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）［８－１１］。目前已从根霉属中分离到超过３０种脂肪酶，如米根霉脂肪酶、雪白根霉脂肪酶、德氏根霉脂肪酶等，这些酶已经商品化，如根霉脂肪酶用于芳香酯［6］、生物柴油［12］、手性化合物［１3］等有机化学物的制备，因此根霉脂肪酶具有一定的研究价值。
目前，已经从不同种属的微生物中分离得到产脂肪酶菌株，并对其进行了深入研究。随着分子生物学［１4］的发展，国内外报道了不同来源微生物脂肪酶基因已被成功克隆［１5］，通过数据库比对分析脂肪酶序列，可以发现在相同或者相近的种属内脂肪酶的同源性相对较高，从而找到相对保守的结构域。本研究从石林香料植物天竺葵叶表面分离到一株产脂肪酶菌株，通过提取基因组ＤＮＡ以真菌通用引物（ＩＴＳ１／ＩＴＳ４）进行ＰＣＲ扩增，并结合形态学对该菌株进行鉴定，然后设计引物利用ＰＣＲ扩增米根霉脂肪酶全基因序列，并对分离菌株进行发酵代谢成分分析，为米根霉的运用提供了异源表达和分子育种材料，为其代谢产物的研究和开发奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 菌株 由石林香料天竺葵样品中自行分离、纯化并保存的菌株。
１．１．２ 主要试剂和仪器 酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、乙酸乙酯、无水硫酸钠等均为国产分析纯；２×Ｐｏｗｅｒ Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ试剂盒、ＢＭ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋ购自北京百泰克生物有限公司；引物合成及测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。仪器包括离心机、ＰＣＲ仪、旋转蒸发仪、美国Ａｇｉｌｅｎｔ ７８９０／５９７５型气质联用仪、Ａｇｉｌｅｎｔ色谱工作站、ＮＩＳＴ ０５谱库等。
１．１．３ 培养基 酵母液体培养基：酵母膏１０ ｇ、蛋白胨２０ ｇ、葡萄糖２０ ｇ，加水定容至１ ０００ ｍＬ。酵母固体培养基：酵母膏１０ ｇ、蛋白胨２０ ｇ、葡萄糖２０ ｇ、琼脂粉２０ ｇ，加水定容至１ ０００ ｍＬ。油脂培养基：蛋白胨１０ ｇ、牛肉膏５ ｇ、ＮａＣｌ ５ ｇ、香油１０ ｇ、１．６％中性红水溶液１ ｍＬ、琼脂２０ ｇ，加水定容至１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．２。发酵液体培养基：蓖麻油５ ｍＬ、吐温－８０ ０．２ ｇ、市售麦芽粒２０ ｇ，加水定容至１ ０００ ｍＬ。
１．２ 方法
１．２．１ 产香菌株的分离和筛选 将天竺葵的叶片用无菌剪刀由叶柄端剪下接种于装有３０ ｍＬ已灭菌的酵母液体培养基的２００ ｍＬ三角瓶中，置于２８ ℃恒温培养箱中富集培养２～３ ｄ，待培养基变浑浊，样品表面形成菌时将其进行梯度稀释，涂布于新鲜的酵母固体培养基平板上，置于２８ ℃恒温培养，待长出菌落后进行纯化培养并将其接种于发酵液体培养基中，置于２８ ℃恒温摇床培养３ ｄ，通过嗅觉初步判断发酵液是否产生香味，斜面保存菌种。
利用因ｐＨ改变而变色的化合物作为指示剂对产脂肪酶菌株进行筛选，先将分离、纯化的菌株接种于酵母固体培养基平板中，置于２８ ℃培养箱中恒温培养３ ｄ，进行菌种活化，待其生长后再将其接种于油脂培养基平板中，置于３７ ℃培养箱中培养，待菌生长后观察平板底层，如果出现红色斑点则为阳性，说明有脂肪酶产生。
１．２．２ 产香菌株的形态学观察和１８Ｓ ｒＤＮＡ鉴定
１）形态学观察。将菌株接种于酵母培养基平板上，于２８ ℃恒温培养２ ｄ。参考《真菌分类学鉴定手册》［１6］对菌落形态和显微形态进行观察。
２）ＤＮＡ提取和ＩＴＳ ｒＤＮＡ 序列ＰＣＲ扩增。用酵母培养基平板培养ＴＺＫ－１，待其生长后刮取并收集菌丝，根据He［１7］ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法提取该菌株基因组总ＤＮＡ，略有改进。以提取的总ＤＮＡ为模板，用ＩＴＳ通用引物ＩＴＳ１（５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３′）和ＩＴＳ４（５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′）进行ＰＣＲ扩增。采用２×Ｐｏｗｅｒ Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 试剂盒，扩增总体系５０ ？滋Ｌ。反应体系：２×Ｐｏｗｅｒ Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２５ ？滋Ｌ，上、下游引物各２ ？滋Ｌ，ＤＮＡ １１ ？滋Ｌ，ｄｄＨ２Ｏ １０ ？滋Ｌ。扩增条件：９４ ℃，３ ｍｉｎ；９４ ℃，４０ ｓ；５５ ℃，４０ ｓ；７２ ℃，１ ｍｉｎ，共３０个循环；７２ ℃，１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物采用１．５％琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增的ＰＣＲ产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果在ＮＣＢＩ上进行ＢＬＡＳＴ比对，并用Ｂｉｏｅｄｉｔ软件进行多序列比对，再提交序列至ＧｅｎＢａｎｋ，获取登录号。
１．２．３ 脂肪酶基因扩增及其序列分析 以提取的基因组总ＤＮＡ为模板，根据脂肪酶高度保守序列的引物Ｚ１、Ｚ２（表１）对该基因进行ＰＣＲ扩增， ＰＣＲ扩增体系同上，采用２×Ｐｏｗｅｒ Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 试剂盒。扩增条件：９４ ℃，３ ｍｉｎ；９４ ℃，１ ｍｉｎ；５２ ℃，４５ ｓ；７２ ℃，１ ｍｉｎ，３０个循环；７２ ℃，１０ ｍｉｎ，１．５％琼脂糖凝胶电泳检测并对扩增的ＰＣＲ产物进行测序。
根据测序结果在ＮＣＢＩ上对保守序列进行比对，选取同源性高的菌株，利用Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２软件对选取菌株进行比对，寻找保守序列。利用Ｐｒｉｍｅｒ ５．０软件根据保守序列设计引物Ｚ３、Ｚ４（表１），对该菌脂肪酶基因进行ＰＣＲ扩增， ＰＣＲ扩增体系同上。反应条件：９４ ℃，３ ｍｉｎ；９４ ℃，１ ｍｉｎ；５９ ℃，４５ ｓ；７２ ℃，１ ｍｉｎ ３０ ｓ，３５个循环；７２ ℃，１０ ｍｉｎ。１．５％琼脂糖凝胶电泳检测并对扩增的ＰＣＲ产物进行测序。
根据测序得到的上述２次核苷酸序列拼接设计引物ＬＡＤ１－１（表１），利用引物ＬＡＤ１－１、Ｚ２ ＰＣＲ扩增该脂肪酶的全基因序列，ＰＣＲ扩增体系同上。反应条件：９４ ℃，３ ｍｉｎ；９４ ℃，１ ｍｉｎ；５２ ℃，４５ ｓ；７２ ℃，１ ｍｉｎ，３０个循环；７２ ℃，１０ ｍｉｎ，１．５％琼脂糖凝胶电泳检测并将扩增的ＰＣＲ产物送去测序。测序结果在ＮＣＢＩ上进行ＢＬＡＳＴ比对，利用ＢＬＡＳＴ搜索ＧｅｎＢａｎｋ数据库中与该序列同源性较高的菌株序列，采用Ｂｉｏｅｄｉｔ软件进行多序列比对，利用软件ＭＥＧＡ ５．０以Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ法构建产脂肪酶菌株的系统发育树，Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值为１ ０００。
２ 结果与分析
２．１ 产香菌株的分离、筛选
利用酵母液体培养基对天竺葵的叶片进行富集培养，酵母培养基变浑浊，样品表面有菌形成，将其进行梯度稀释涂布于酵母固体培养基中培养，成功分离得到菌株，对其进行纯化。再将分离、纯化的菌株接种于发酵液体培养基中进行产香筛选，培养３ ｄ后对其发酵液进行产香嗅觉初步判断。结果发现，分离、纯化得到的菌株能产生浓郁的甜酒香味，成功筛选得到一株产香菌株。将分离、纯化的产香菌株命名为ＴＺＫ－１。将ＴＺＫ－１菌株接入油脂培养基平板培养，以筛选产生脂肪酶的菌株，经过３７ ℃恒温培养２ ｄ观察到ＴＺＫ－１菌株平板底层出现红色斑点，如图１所示。由此可见，该菌株为脂肪酶产生菌。
２．２ 产香菌株的形态学和１８Ｓ ｒＤＮＡ鉴定
ＴＺＫ－１菌株在酵母培养基培养２ ｄ后，菌落圆形，质地疏松，菌丝由白色变为灰褐色；在显微镜下观察到菌丝无隔膜，有假根，孢囊梗基部膨大形成球形孢子囊，孢囊孢子椭圆形，如图２所示。参考真菌分类鉴定手册，初步确定为根霉属。以ＴＺＫ－１菌株的ＤＮＡ为模板，利用真菌通用引物ＩＴＳ１／ＩＴＳ４进行ＰＣＲ扩增并对相应ＰＣＲ产物进行测序。测序结果表明，该菌株长度为６１１ ｂｐ，将序列提交ＧｅｎＢａｎｋ获得登陆号为ＫＪ７５５４４４。利用ＢＬＡＳＴ软件将所得基因序列与ＮＣＢＩ数据库的序列进行同源性比较分析，利用Ｂｉｏｅｄｉｔ进行多序列比对，结果见表２。分析结果表明，ＴＺＫ－１菌株与Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＫＦ７１７３７０）菌株的同源性较高，达到９９．６％，ＴＺＫ－１菌株与米根霉可能具有共同的起源。
２．３ 脂肪酶基因扩增及系统发育分析
以提取的ＴＺＫ－１总ＤＮＡ为模板，利用引物Ｚ１、Ｚ２进行脂肪酶基因ＰＣＲ扩增，结果得到约４００ ｂｐ的扩增产物，与预期结果一致。根据测序结果在ＮＣＢＩ上对保守序列进行比对，选取同源性高的菌株，利用Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２软件对选取的菌株进行比对，寻找保守序列。利用Ｐｒｉｍｅｒ ５．０软件设计的引物Ｚ３、Ｚ４对该菌脂肪酶基因进行ＰＣＲ扩增，结果得到约８００ ｂｐ的扩增产物，与预期结果一致。
根据２次测序结果拼接核苷酸序列设计引物ＬＡＤ１－１，利用引物ＬＡＤ１－１、Ｚ２扩增完整的目的基因，经测序、拼接得到完整的脂肪酶基因，该脂肪酶基因片段大小为１ １０８ ｂｐ，编码３６９个氨基酸。经过３次ＰＣＲ扩增，成功扩增得到脂肪酶基因，并利用凝胶成像系统观察，结果如图３所示。
将扩增得到的序列与ＧｅｎＢａｎｋ数据库中序列进行比对，选取比对的１４组核苷酸序列进行系统发育分析，用软件ＭＥＧＡ ５．０以Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ法构建产脂肪酶菌株的核苷酸系统发育树，结果如图４所示。结果表明，菌株ＴＺＫ－１与Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＡＦ２２９４３５）和Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＪＮ６８９９８８）聚为一支，支持强度达到９２％，同源性分别达到９９．５％和９６．６％，与其同源性最低的是Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ ｖａｒ． ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（ＥＦ４０５９６２），同源性为５５．６％，可以看出ＴＺＫ－１脂肪酶在遗传距离上与Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ比较近，与Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ ｖａｒ． ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ较远。
将扩增得到的米根霉脂肪酶基因序列翻译成氨基酸序列后，利用ＭＥＧＡ ５．０软件构建产脂肪酶菌株的氨基酸系统发育树，结果如图５所示。由图５可知，菌株ＴＺＫ－１与Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＡＦ２２９４３５）和Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＪＮ６８９９８８）聚类成一支，支持强度达到９５％，同源性分别达到９７．５％和９６．１％，与其同源性最低的是Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ（ＧＵ４７５１１９），同源性为９．７％。由此可知，无论在核苷酸水平还是氨基酸水平上，扩增得到的脂肪酶都与Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ脂肪酶具有较高的相似性，因此初步认为扩增得到的脂肪酶基因为米根霉脂肪酶基因。
３ 小结与讨论
米根霉脂肪酶具有高度的１、３位置特异性，可以水解和再合成三甘油酯的第一位酯键，可以用来水解、重组脂肪和油脂，在芳香酯、手性化合物、生物柴油等有机物的合成中具有较高价值。伴随着脂肪酶的商业价值问题也是突出的，其中包括天然菌株产脂肪酶产量低，酶与菌体分离纯化困难，产物纯度达不到工业化生产要求等问题，因此利用分子生物学手段扩增脂肪酶基因作为一种高效表达的生产方法已经成为研究的热点。
本研究从采集的香料植物天竺葵样品中分离得到一株产脂肪酶菌株，通过对该菌进行形态学观察和１８Ｓ ｒＤＮＡ序列测定，测序结果表明该菌株与米根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）具有最高的遗传相似性，再结合形态学可以确定该菌株为米根霉。通过ＰＣＲ扩增该菌株脂肪酶基因和ＮＣＢＩ数据库比对，发现扩增得到的脂肪酶基因与ＮＣＢＩ提交的Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＡＦ２２９４３５）和Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＪＮ６８９９８８）脂肪酶核苷酸和氨基酸序列具有着较高的同源性。说明本研究成功扩增得到全长为１ １０８ ｂｐ，编码３６９个氨基酸的基因可能为米根霉脂肪酶基因，为挖掘我国的产脂肪酶微生物及其对脂肪酶的研究提供了材料。
ＴＺＫ－１菌株在发酵培养基培养过程中，能产生浓郁的甜酒香味，这种香味的存在可能与菌株产生的某种或某些代谢产物有关，同时菌株代谢过程中产生的甜酒气味可能与脂肪酶的存在有着某种联系，这对米根霉产香化合物的发酵优化提供理论指导。探究该菌产香化合物的发酵优化及其产生的有关代谢产物组成，并对产香代谢化合物进行分离、提纯将成为后期研究的内容。
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（责任编辑 赵 娟）
