李 祝１，万 科１，丛 铭１，张传萍１，施渺筱２
（１．贵州大学生命科学学院真菌资源研究所，贵阳 ５５００２５；２．贵州省安顺学院农学院，贵州 安顺 ５６１０００）
摘要：采用温室盆栽试验测试５株芽孢杆菌属生防细菌对烟草黑胫病的拮抗作用。结果表明，拮抗细菌芽孢杆菌１２０５对苗期烟草黑胫病有较稳定的防治效果，其分泌物还有促进烟株生长的作用，经鉴定１２０５菌株为蜡样芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ：拮抗细菌；烟草黑胫病；盆栽试验
中图分类号：Ｓ４３５．７２ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）05－1094-03
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.016
收稿日期：２０１４－０６－１６
基金项目：贵州省科学技术厅、安顺市人民政府、安顺学院联合科技基金项目（黔科合Ｊ字ＬＫＡ［２０１２］０６号）；毕节市烟草公司项目
作者简介：李 祝（１９７８－），女，贵州毕节人，教授，博士，主要从事农业微生物学研究，（电话）１３５９５１５５０８１（电子信箱）ｚｈｕｌｉｌｕｃｋ＠１６３．ｃｏｍ。
烟草黑胫病［Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ. ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ（Ｂｒｅｄａ ｄｅ Ｈｅａｎ）Ｔｕｋｅｒ］俗称烂腰病、黑根病，是一种常见的土传真菌病害。烟草黑胫病在苗床及大田中均可发生，尤其是在高温高湿、多雨年份及低洼地区，该病发展蔓延快，在１～２周内可造成整块烟田毁灭，导致绝收［１，２］。随着生物技术的发展和相关研究的深入，生物防治成为烟草黑胫病的研究重点，特别是在利用有益微生物进行病害防治等方面［３－７］。本研究对筛选出来的５株生防细菌进行盆栽防效试验，以研究其对烟草黑胫病的拮抗作用。
１ 材料与方法
１．１ 材料
烟草黑胫病菌病原菌烟草疫霉（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ Ｇｚｕｆｐ－９）由贵州大学生命科学院真菌资源研究室提供。拮抗细菌为芽孢杆菌１１０７、７４０３、１２０５、１６０１、５８０１菌株。烟草品种为毕纳１号。
１．２ 盆栽试验方法
１．２．１ 烟草育苗 采用漂浮育苗法，育苗前将浮盘和盛水方盘进行消毒，检查盘孔是否堵塞，用松散基质填满孔穴，用手指轻微下压至有实落感，约下压１ ｃｍ，然后装满刮平露出盘面孔格，每孔播种毕纳1号种子２~３粒，播种后不再盖基质，立即放入盛有适量水的方盘内。待出苗具备２片真叶时即可进行间苗，确保每孔内有1株均匀一致的烟苗。在烟苗已具有４叶１心，苗高３～４ ｃｍ时剪叶，剪去超过盘孔的根系控制大苗生长，促使小苗生长。后期剪叶两次，促进茎部的生长，达到炼苗的目的［８］。移栽，每盆１株，１０ ｄ后进行处理。
１．２．２ 烟草疫霉孢子悬浮液的制备 利用已分离出的烟草疫霉菌菌株Ｇｚｕｆｐ－９，参照烟草疫霉孢子悬浮液制备方法［９］制备烟草疫霉孢子悬浮液，孢子浓度为１０４个／ｍＬ。
１．２．３ 拮抗细菌接种物的制备 在ＮＡ平板上将分离得到的拮抗菌株１１０７、７４０３、１２０５、１６０１和５８０１活化，取两环活化的培养物分别接入盛有１００ ｍＬ ＮＡ培养液的２５０ ｍＬ三角瓶中，２８ ℃、１６０ ｒ／ｍｉｎ培养３ ｄ，得到拮抗菌株悬浮液。
１．２．４ 接种方法 病原菌接种采用王丽珍［１０］的方法，将烟草疫霉孢子悬浮液灌根接种于烟株根部土壤中。拮抗细菌采用灌根接种法，将已经制备好的浓度为１×１０８个／ｍＬ拮抗菌发酵液灌根，接种于烟株根部土壤中。选择长势大小相近，苗龄４０ ｄ的烟苗，移栽到盆内，每盆１株，移栽１０ ｄ后接种，试验设６个处理，每个处理１５株，设３次重复。①处理组１：在烟株移栽１０ ｄ后，首先接种拮抗菌发酵液１０ ｍＬ，１０ ｄ后再接种烟草黒胫病病原菌游动孢子悬浮液（１０４个／ｍＬ）１０ ｍＬ；②处理组２：在烟株移栽１０ ｄ后同时接种烟草黒胫病病原菌游动孢子悬浮液（１０４个／ｍＬ）１０ ｍＬ和拮抗菌发酵液１０ ｍＬ；③处理组３：在烟株移栽１０ ｄ后，首先接种烟草黒胫病病原菌游动孢子悬浮液（１０４个／ｍＬ）１０ ｍＬ，１０ ｄ后再接种拮抗菌发酵液１０ ｍＬ；④发病对照组：在烟株移栽１０ ｄ后只接种烟草黒胫病病原菌游动孢子悬浮液（１０４个／ｍＬ）２０ ｍＬ，不接种拮抗菌；⑤拮抗菌对照组：在烟株移栽１０ ｄ后接种拮抗菌发酵液２０ ｍＬ，不接种病原菌；⑥空白对照组：在烟株移栽１０ ｄ后接种清水２０ ｍＬ。
１．３ 小区试验
在贵州省毕节市黔西县进行田间试验，所有试验小区的栽培条件均匀一致，试验期间管理按照常规进行，拮抗菌田间药效试验小区按随机排列的方式进行。
１．３．１ 施药方法 在烟株移栽前采用拮抗菌发酵液喷洒方式施用到土壤中，移栽后拮抗菌以灌根的方式接种到烟株根部。选用生产中常用的器械，菌种发酵采用泰斯特６０００Ⅱ型培养箱，记录所用器械的类型和操作条件的全部资料。菌种的施用应保证接种量准确，分布均匀。接种量偏差超过±１０％的要记录。第一次接种在烟株移栽前１０ ｄ，烟株移栽后每隔１０ ｄ接种１次，共接种３次，记录每次接种的日期和作物生育期。分别配置菌悬液浓度为１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９个／ｍＬ的１２０５菌株制剂，每株接种２０ ｍＬ。设阳性药对照处理，在烟株移栽前１０ ｄ接种５８％甲霜灵·锰锌可湿性粉剂（８００×）喷淋茎基部。每处理设４次重复，每个小区面积为１５ ｍ２，随机区组排列，小区间筑埂隔离，以防药液串流。
１．３．２ 调查、记录和测量方法 接种前调查１次，分别在施药后７、１４、２１ ｄ各调查１次。病害分级标准按国家行业标准ＹＣ／Ｔ３９-１９９６规定执行。病情分级标准如下：０级，全株无病；１级，茎部病斑不超过茎围的１／２或１／２以下，叶轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑；２级，茎部病斑超过茎围的１／２或１／２以上叶片凋萎；３级，茎部病斑环绕茎围或２／３以上叶片凋萎；４级，病株全叶凋萎或枯死。目测法调查记录拮抗菌对目标病原菌的拮抗效果，同时记录对作物有益的影响（如加速成熟、增加活力等）。药效按公式（１）和（２）计算。
式中，对照病指为空白对照区接菌后的病情指数；处理病指为拮抗试验区接种拮抗菌后的病情指数。
１．３．３ 拮抗细菌对烟株生长的影响 以烟株生长后期为观测样本，每处理随机选择２５株，分别测量其株高、节距、茎围、叶长、叶宽、有效叶片数等指标。对各处理的促生效果采用数据处理系统ＳＰＳＳ１７．０进行Ｋ－Ｓ检验。
２ 结果与分析
２．１ 拮抗细菌盆栽防效的筛选
通过盆栽试验，接种５ ｄ后，分别对各个处理进行调查。空白对照、拮抗菌对照和处理组２均未发病，而发病对照、处理组１和处理组３中的烟株已陆续发病，处理组３中的有些烟株发病级数也从１级达到了４级。
烟苗移栽４０ ｄ时，拮抗菌对照长势良好（表１）；处理组１中发病指数都相对较低，各菌株的防效都达到了６５.00％以上，尤其１２０５菌株相对防效达到了８０．４４％；处理组２中１６０１、７４０３、５８０１菌株处理的烟株发病指数相对较高，而经１１０７和１２０５菌株处理的烟苗生长良好，尤其１２０５菌株相对防效达到了８４．７９％；处理组３中发病指数相对较高，１６０１、５８０１、７４０３菌株处理的烟株相对防效在３０.00％以下，只有１２０５菌株的相对防效达到了７８．２３％。由此可见，１２０５菌株对病原菌不仅有预防效果，还有较好的治疗和钝化作用。因此，选取１２０５菌株进行浓度筛选试验。
２．２ １２０５菌株的小区试验
为了更充分地说明１２０５菌株对烟草黑胫病的防效及掌握菌株的施用量，以５８％甲霜灵·锰锌可湿性粉剂为阳性对照药，将１２０５菌株设计了８个菌悬液浓度梯度，采用随机区组排列方法，进行了药筛试验，结果见表２。防治效果随着菌悬液浓度的增加而增加，当菌悬液浓度达到１０５个／ｍＬ时，相对防效就达到了５４．１％，优于化学药剂甲霜灵·锰锌的防效（５０．６％），当菌悬液浓度达到１０９个／ｍＬ时，田间相对防效达到了７５．９％。可见１２０５菌株对于烟草黑胫病的防治效果是稳定的。
２．３ １２０５菌株对烟草植株生长的影响
小区试验中观察１２０５菌株不同菌悬液浓度对烟草植株的生长情况（表３）表明，与对照相比，不同浓度的菌悬液对烟草植株的生长均有不同程度的影响，其中当１２０５菌株菌悬液浓度达到１０９个／ｍＬ时，表现尤为突出，与对照药５８％甲霜灵·锰锌可湿性粉剂相比，株高、茎围、叶长、叶宽、有效叶片数分别增长了１３％、１５％、３％、３３％、１０％；而与对照相比，株高、茎围、叶长、叶宽、有效叶片数分别增长了１３％、１６％、１９％、４０％、１０％。由此可见，１２０５菌株的分泌物还具有促进烟株生长的作用。
２．４ １２０５菌株的种类鉴定
将１２０５菌株接种在普通琼脂平板上，３７ ℃培养３６ ｈ，菌落近圆形，灰白色，不透明，菌落大，直径达３～７ ｍｍ，边缘不整齐呈扩展状，表面粗糙颗粒状似毛玻璃状或蜡状，不分泌色素，为革兰氏阳性细菌，杆状，１．０～１．３ μｍ×３．０～５．０ μｍ，成链，具有运动性，芽孢椭圆形，端生或次端生，芽孢膨大不明显，能耐受７％ＮａＣｌ，接触酶阳性、葡萄糖发酵阳性、淀粉水解阳性、硝酸盐还原阳性、明胶液化阳性、麦芽糖发酵阳性、半固体穿刺试验阳性、酪素水解阳性、ＶＰ试验阴性、柠檬酸盐利用试验阴性、吲哚试验阴性、蔗糖发酵阴性、乳糖发酵阴性、甘露醇水解阴性。参考《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）、《常见细菌系统鉴定手册》和《芽孢杆菌属》，初步鉴定为芽孢杆菌属。将１２０５菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，１６０ ｒ／ｍｉｎ、２８ ℃培养１２ ｈ，离心收集菌体。采用上海生工生物工程股份有限公司生产的柱式基因组ＤＮＡ抽提试剂盒（细菌）提取基因组ＤＮＡ。以提取到的ＤＮＡ为模板，用正向引物１６ＳＦ（５′－ＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′）和反向引物１６ＳＲ（５′－ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡ－３′）对菌株的１６Ｓ ｒＤＮＡ基因进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ扩增条件为：９４ ℃ ３ ｍｉｎ；９４ ℃ ４５ ｓ，５４ ℃ ３０ ｓ，７２℃ １ ｍｉｎ，２５个循环；７２ ℃终延伸５ ｍｉｎ，４ ℃停止。ＰＣＲ产物送上海生工生物工程股份有限公司测序，长度为１ ４６８ ｂｐ。测序结果在ＧｅｎＢａｎｋ中与Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ相似性为９７％。综合菌落形态、生理生化及分子鉴定，将１２０５菌株鉴定为蜡样芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）。
４ 小结与讨论
本试验在对筛选出来的１１０７、７４０３、１２０５、１６０１、５８０１ ５株生防细菌进行盆栽防效试验的过程中，发现１２０５菌株对烟草黑胫病具有较稳定的防治效果，防治效果随着菌悬液浓度的增加而增加。且１２０５菌株的分泌物还具有促进烟株生长的作用。经鉴定１２０５菌株为蜡样芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）。对于１２０５菌株抑制烟草黑胫病的生理机制，尚待进一步研究。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献：
［１］ 王万能，肖崇刚．烟草黑胫病的综合防治及其研究进展［Ｊ］．广西农业科学，２００３（２）：４２－４３．
［２］ 王 静，孔凡玉．烟草黑胫病综合防治技术［Ｊ］．烟草科技，２００２（８）：４５－４７．
［３］ 王万能，全学军，肖崇刚．烟草内生细菌对烟草病害的拮抗和防治作用［Ｊ］．烟草科技，２００６（１）：５５－５７．
［４］ 王万能，全学军，肖崇刚．烟草内生细菌防治烟草黑胫病及促生作用研究［Ｊ］．植物学通报，２００５，２２（４）：４２６－４３１．
［５］ 赵 蕾，梁元存，刘延荣．壳聚糖对烟草抗黑胫病的作用［Ｊ］．应用与环境生物学报，２０００，６（５）：４３６－４３９．
［６］ 方敦煌，李天飞，沐应祥，等．拮抗细菌ＧＰ１３防治烟草黑胫病的田间应用［Ｊ］．云南农业大学学报，２００３，１８（１）：４８－５１．
［７］ 顾金刚，方敦煌，李天飞，等．两株荧光假单胞杆菌菌株对烟草黑胫病病原菌的抑制作用［Ｊ］．中国生物防治，２００４，２０（１）：７６－７８．
［８］ 王 静，孔凡玉，秦西云，等．短小芽孢杆菌ＡＲ０３对烟草黑胫病菌的拮抗活性及其田间防效［Ｊ］．中国烟草学报，２０１０，１６（５）：１０－１２．
［９］ 郑小波．疫霉菌及其研究技术［Ｍ］．北京：中国农业出版杜， １９９７．
［１０］ 王丽珍．烟草根围土壤拮抗细菌的筛选及控病研究［Ｄ］．重庆： 西南大学，２００７．
