李佩华
（西昌学院农业科学学院，四川 西昌 ６１５０１３）
摘要：采用组织培养方法，以马铃薯 （Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）品种米拉（Ｓ． ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｃｖ． Ｍｉｒａ）为供试材料，研究重金属铅（Ｐｂ）、镉（Ｃｄ）胁迫对马铃薯叶绿素含量及叶片超微结构的影响。结果表明，未经处理的马铃薯叶片细胞超微结构完整清晰，片层排列整齐，线粒体结构紧密，分布均匀，细胞壁平滑致密，细胞核中核仁颜色清晰，结构完整。经铅胁迫后，叶绿素含量下降，叶绿体肿胀，类囊体排列紊乱，结构被破坏，线粒体膜部分溶解，细胞壁发生不同类型的变化。镉胁迫后，叶绿素含量显著降低，片层结构模糊，比对照出现了更多的淀粉粒，线粒体变形、嵴消失、空泡化，膜系统破坏明显。说明铅、镉在马铃薯中有一定的蓄积作用，叶绿素含量和细胞超微结构的变化可作为马铃薯对重金属抗性分析的依据。
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关键词 ：铅；镉；马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）；叶绿素；超微结构
中图分类号：Ｏ６１４；Ｓ５３２；Ｑ９４５．１１ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）１６－３９７４－０４
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．１６．０３６
收稿日期：２０１５－０５－１５
基金项目：四川省教育厅重点项目（１２ＺＡ１４９）
作者简介：李佩华（１９７５－），男，四川成都人，副研究员，硕士，主要从事马铃薯育种、栽培生理及良繁技术研究，（电话）１３７７８６１６２６０（电子信箱）Ｌｉｐｅｉｈｕａ＿２００４＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。
在全球工业迅猛发展和经济快速增长的现代社会，城市化的推进所带来的环境污染问题日益严重，其中以重金属的污染最为突出，其直接威胁着人类赖以生存的环境，已成为人类日常生活的安全隐患之一。据统计，中国目前受铅、镉等重金属污染的土壤面积已达２．０×１０７ ｈｍ２，约占耕地总面积的１／５［１］，每年因重金属污染导致的粮食经济损失至少达２００亿元［２］，重金属污染已成为当今世界备受关注的重大环境问题之一［３，４］。重金属毒性大，且半衰期较长，若长期在环境中积累，会危害生态系统安全，影响动物、植物的生长发育繁殖，进而通过食物链富集到食物金字塔的顶端，最终进入人体中［５－１３］危害人体健康。重金属污染中又以铅、镉的迁移能力最强，危害最为严重；铅可在人体和动物、植物组织中积累并长期蓄积，其主要来源于工业废水及汽车尾气；镉则是一种剧毒的重金属元素，主要来源于工业“三废”；所以这２种重金属已成为目前的研究热点［１４］。近年来，镉米、血铅等重金属污染事件时常见诸报端，且多集中在经济作物对镉、铅等的吸收、积累与转移方面。目前，国内大多数城市郊区的土壤都受到了不同程度的污染，许多粮食、蔬菜、水果等食物中铅、镉等重金属含量接近临界值或超标。马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）是世界四大粮食作物之一，其产量仅排在小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）、玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）和水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）之后［１５］，因其具有易栽培、营养价值高、经济效益大的特性而成为食品工业和医药工业不可缺少的重要原料之一。中国是世界上最大的马铃薯生产国，种植面积广，栽培品种多，马铃薯在农业领域以及消费市场上占有不可替代的地位，为国家创造了巨大的经济财富。然而随着土壤重金属污染面积的不断扩大，加上其食用部分直接与土壤接触，所以受重金属铅、镉污染毒害程度的威胁在不断加大，因此研究重金属对马铃薯的胁迫毒害机理具有十分重要的意义。试验以马铃薯为供试材料，研究了铅、镉胁迫下马铃薯的叶绿素含量及叶片超微结构的变化，为探讨马铃薯对重金属的抗性机理提供生理学及细胞形态学的依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
供试马铃薯品种为米拉（Ｓ． ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ｃｖ． Ｍｉｒａ），试验材料为米拉脱毒组培苗，由西昌学院高原及亚热带作物实验室提供。试剂主要有乙醇、丙酮、磷酸、戊二醛（用ｐＨ＝６．８的磷酸缓冲液配制）、四氧化锇（ＯｓＯ４）固定液（１％锇酸）、醋酸双氧铀、柠檬酸铅以及Ｅｐｏｎ８１２树脂等。主要仪器有岛津ＵＶ－２４０１ＰＣ型紫外可见光分光光度计（日本岛津制作所）、Ｕｌｔｒａ Ｃｕｔ－Ｅ型超薄切片机（奥地利Ｒｅｉｃｈｅｒｔ－Ｊｕｎｇ公司）、日立Ｈ－６００ＩＶ型透射式电子显微镜（日本日立株式会社）。
１．２ 试验设计
试验在四川省西昌学院的组织培养室进行，分别配制不同铅、镉污染水平处理的ＭＳ培养基，铅胁迫处理水平分别为０（ＣＫ）、１ ０００ ｍｇ／ｋｇ，铅用Ｐｂ（ＣＨ３ＣＯＯ）２配制；镉胁迫处理水平分别为０（ＣＫ）、１００ ｍｇ／ｋｇ，镉用ＣｄＣｌ２·２．５Ｈ２Ｏ配制，调整培养基ｐＨ为５．８，在高温高压锅内灭菌，冷却。在超净工作台上转接含有腋芽、长度为２ ｃｍ的米拉脱毒组培苗茎切段，按照原来的极性生长方向着位于培养瓶中，每个处理５瓶，每瓶１０苗，转入培养室（２５ ℃，每日光照１２ ｈ，光照度为２ ０００ ｌｘ）内培养，重金属胁迫处理３０ ｄ后，收获供试植物。
１．３ 分析方法
１．３．１ 叶片色素含量的测定 取马铃薯主茎从上向下数第三、第四对叶片，采用乙醇－丙酮混合提取法［１６］测定叶绿素及类胡萝卜素的含量，重复３次，取其均值，计算叶绿素a/叶绿素b的值；试验数据经ＳＡＳ ８．０软件处理，并进行方差分析。
１．３．２ 叶片超微结构的电镜观察 采集样品经３％戊二醛预固定、１％四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，Ｅｐｏｎ８１２包埋，半薄切片光学定位、超薄切片，醋酸双氧铀及枸橼酸铅双重染色，用电子显微镜观察、拍照。
２ 结果与分析
２．１ 铅、镉胁迫对马铃薯叶片色素含量的影响
铅、镉胁迫对马铃薯叶片色素含量的影响情况见表１。由表１可知，在铅（浓度为１ ０００ ｍｇ／ｋｇ）胁迫下，马铃薯叶片的叶绿素ａ、叶绿素ｂ和类胡萝卜素合成都受到了抑制，与对照相比含量都显著降低（Ｐ＜０．０５），其中叶绿素ａ含量降低了２１．２％，叶绿素ｂ含量降低了２８．７％，类胡萝卜素含量降低了３４．２％；使叶绿素ａ／叶绿素ｂ的值略有增大，但与对照相比差异不显著（Ｐ＞０．０５），说明铅对马铃薯叶片叶绿素和类胡萝卜素的合成具有相当的抑制作用。在镉（浓度为１００ ｍｇ／ｋｇ）胁迫下，马铃薯叶片的叶绿素ａ、叶绿素ｂ和类胡萝卜素合成也受到了抑制，与对照相比含量也都显著降低（Ｐ＜０．０５），其中叶绿素ａ含量降低了３９．０％，叶绿素ｂ含量降低了３５．４％，类胡萝卜素含量降低了３１．４％；使叶绿素ａ／叶绿素b的值略有降低，但与对照相比差异不显著（Ｐ＞０．０５），说明镉对马铃薯叶片叶绿素合成具有更强的抑制作用。
２．２ 铅胁迫对马铃薯叶片超微结构的影响
铅胁迫下马铃薯叶片细胞超微结构的变化情况见图１。由图１可知，对照的马铃薯叶片细胞超微结构清晰完整，叶绿体呈圆形或椭圆形，数量多，在细胞中所占比例大，并且结构层次分明（图１－ａ、图１－ｃ、图１－ｄ）；类囊体片层清晰，排列有序；线粒体分布均匀，结构紧密（图１－ａ、图１－ｃ），淀粉粒少且小，存在于叶绿体中（图１－ａ）；嗜饿颗粒在叶绿体、线粒体中均有分布，但数量较少（图１－ａ、图１－ｂ、图１－ｄ）；细胞壁清晰，平滑致密，细胞核中核仁颜色清晰，结构完整（图１－ａ）。
与对照相比，经铅（浓度为１ ０００ ｍｇ／ｋｇ）胁迫处理３０ ｄ后，马铃薯叶片超微结构发生了明显的变化，其叶绿体肿胀呈圆球形，膜结构模糊，类囊体结构断裂甚至消失，片层结构颜色变浅，比较分散，排列杂乱无序（图１－ｅ、图１－ｆ）；叶绿体中出现了大而饱满的淀粉粒，且数量急剧增加（图１－ｅ、图１－ｆ）；嗜饿颗粒形态大而圆润，所占比例大（图１－ｅ、图１－ｆ）；线粒体双层膜发生溶解，嵴减少或消失，内部空泡化（图１－ｇ、图１－ｈ）；细胞壁增厚，颜色变深，有些甚至出现质壁分离现象（图１－ｆ、图１－ｈ），细胞核核膜破裂，有少量内容物流出，核仁颜色变浅（图１－ｇ）。
２．３ 镉胁迫对马铃薯叶片超微结构的影响
镉胁迫下马铃薯叶片细胞超微结构的变化情况见图２。由图２可知，对照的马铃薯叶片细胞超微结构清晰完整，叶绿体呈圆形或椭圆形，数量多，在细胞中所占的比例大，并且结构层次分明（图２－ａ、图２－ｃ、图２－ｄ）；类囊体片层清晰，排列有序；线粒体分布均匀，结构紧密（图２－ａ、图２－ｃ），淀粉粒少且小，存在于叶绿体中（图２－ａ）；嗜饿颗粒在叶绿体、线粒体中均有分布，但数量较少（图２－ａ、图２－ｂ、图２－ｄ）；细胞壁清晰，平滑致密，细胞核中核仁颜色清晰，结构完整（图２－ａ）。
与对照相比，镉（浓度为100 mg/kg）胁迫处理３０ ｄ后马铃薯叶片的超微结构受到了严重破坏，其叶绿体膜结构完全改变（图２－ｅ）；片层结构模糊不清，出现了丝状形态，造成类囊体片层数量减少，有少量基质溢出（图２－ｈ）；线粒体轻微膨胀呈椭圆形，嵴部分消失，结构解体，数量变少（图２－ｈ）；出现巨型淀粉粒，形态饱满几乎充满整个叶绿体，所占比例更大（图２－ｅ、图２－ｆ、图２－ｇ、图２－ｈ）；嗜饿颗粒数量少，且颜色变浅（图２－ｅ、图２－ｇ）；细胞壁增厚，细胞膜紧贴细胞壁，界限模糊（图２－ｆ、图２－ｈ）。
３ 小结与讨论
植物受重金属胁迫的重要特征之一是叶绿素含量下降［１７］，试验结果表明，在铅（浓度为１ ０００ ｍｇ／ｋｇ）胁迫后，马铃薯叶片叶绿素的合成受阻，叶绿素ａ、叶绿素ｂ、类胡萝卜素含量均显著下降（Ｐ＜０．０５）；不过叶绿素ａ／叶绿素ｂ的数值与空白对照相比无显著差异。镉（浓度为１００ ｍｇ／ｋｇ）胁迫后叶绿素含量也降低，各色素的含量均显著低于空白对照（Ｐ＜０．０５），与铅胁迫处理相比叶绿素含量更低，说明马铃薯对镉更敏感，受到的毒害作用比铅还要严重，也说明马铃薯对铅有一定的耐受性。叶绿素含量的变化可能是镉胁迫致使叶片中的铁含量减少，加上镉自身对叶绿素新陈代谢的消极影响，导致叶绿素的降解和生物合成受到累加抑制［１８］。
在重金属铅、镉胁迫下，马铃薯叶片细胞内超微结构发生了不同程度的变化。铅胁迫给马铃薯叶片细胞超微结构特别是叶绿体、线粒体及膜系统造成了严重伤害，如叶绿体结构改变呈肿胀态，片层结构变细变长出现丝状形态，类囊体排列紊乱，同时比空白对照出现了更多形态大而饱满的淀粉粒，嗜饿颗粒大而圆润，二者所占比例增加，线粒体膜部分溶解，细胞壁增厚，颜色变深，部分发生质壁分离。镉胁迫后，嵴消失，出现空泡化，内部结构解体，失去完整性，叶绿体膜结构大部分被破坏，基粒片层颜色加深，与铅胁迫相比出现更加饱满的淀粉粒，而嗜饿颗粒数量变少、颜色变浅，膜系统破坏明显，细胞膜紧贴细胞壁，界限模糊。胡金朝等［１９］在研究重金属胁迫对植物细胞超微结构的损伤中，发现不同重金属离子对植物细胞超微结构的损伤效应不同，但又存在相似性，以及不同细胞器对重金属的耐受性也存在差异。本试验的结论与胡金朝等的研究结果是一致的。
叶绿体和线粒体是细胞中２个非常重要的能量转换器，能为马铃薯的生长提供必需的能量，经重金属胁迫后细胞器功能受到不同程度的损害，这就会影响马铃薯光合作用、呼吸作用等正常运行。叶绿体是合成叶绿素的主要细胞器，细胞核是遗传代谢的控制中心，两者对马铃薯的正常生长和生理代谢发挥着重要作用。重金属对马铃薯叶片细胞超微结构的损伤是整体性的破坏，因此将叶绿素含量和细胞超微结构的变化作为衡量重金属污染后的植物响应指标之一，可以为研究马铃薯对重金属的抗性机理和生理生化机理提供细胞学依据。
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