李 伟1，王 芳2，殷元虎1，郭春晖1，殷溪瀚3
（1．黑龙江省畜牧研究所161005；2．齐齐哈尔大学生命科学与农林学院 161006；3．黑龙江八一农垦大学动物科技学院 163319）
摘要：蛋白质组学是对基因组学研究的重要补充，生命的各个过程都受到蛋白质间相互作用的控制。它是一个客观的、复杂的、交错并精密调控的反应网络。在动物发育、生理生态、疾病等研究中得到广泛应用。如何利用系统生物学的理念，将这些研究成果加以整理、整合，从而在蛋白质水平上对生命现象加以解释，这需要遗传学、化学、生物学、细胞生物学、工程学、数学、信息学等多学科学者共同的努力。本文介绍了蛋白质组学发展背景和关键技术的研究情况，并对蛋白质组学在牛属动物疾病中的研究与应用进行了阐述。同时对蛋白质组学的发展前景进行了讨论。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ：蛋白质组学；牛；疾病；生物信息学；乳房炎；蛋白质芯片技术
1 蛋白质组学的发展背景
1953年，Watson和Crick建立了著名的DNA双螺旋结构模型，标志着基因时代的到来。1990～2001年人类基因组计划( Human Genomic Project，HGP)的完成。2001年2月15日，在Nature上一篇“现在应该是蛋白质组了”的消息，宣布了人类蛋白质组组织( Human Proteome Organization，HU-PO)成立，并提出了人类蛋白质组计划(HumanProteome Project，HPP)，标志着人类进入了后基因组时代。现在我们已经知道，机体内各种生命信息由不同基因经转录、翻译，传递到相应蛋白质进行表达，表现为生命活性。目前，以对生物体或细胞的所有蛋白质进行鉴定和结构功能分析为基础，获得蛋白质水平上关于疾病发生，细胞代谢，营养吸收等过程的全面认识为研究目标的蛋白质组学越来越受到人们的重视。蛋白质组( proteome)的概念最早由Wasinger V.C．(1995)提出，是指由一个基因组编码的所有蛋白质。澳大利亚学者Wilkins M R& Williams K L(1997)第一次在专著中使用并定义为：一个基因组或组织所表达全部蛋白质。现在蛋白质组可以理解为一种生物、个体、器官、组织、细胞及体液等的基因组所表达的全部蛋白质，蛋白质组学研究内容包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等。需要指出的是一个蛋白质组并不是一个基因组的直接产物，机体蛋白质组中蛋白质的数量要远远多于基因组中基因的数量。蛋白质之间的相互作用和协调是细胞代谢活动的基础，在细胞增值，分化，凋亡和衰老等生命活动中，蛋白质不仅有表达时间、表达量上的差异，而且能对外界环境刺激（物理、化学、生理、病理信号）等刺激产生反应，形成基因缓冲从而适应环境变化。生命每个过程都受到蛋白质间相互作用的控制。它是一个客观的、复杂的、交错的并精密调控的反应网络。因此，要得到细胞内全部蛋白质组十分困难。为此，Humphery Smith et al. (1997)提出功能蛋白质组的概念，指在特定时间、特定环境和实验条件下基因组所表达的蛋白质。
2 蛋白质组学研究领域与研究内容
蛋白质组学研究已经渗透到临床医学、预防医学、基础医学、药学、动物学、植物学、植物病理学、营养学等多个学科领域。主要分为三个方向：①对蛋白质的大规模识别和翻译后加工修饰的细微特征分析，称为组成蛋白质组学；②借助蛋白质差异性显示法进行分析蛋白质的水平，称为差异显示蛋白质组学(differential display proteomics)又叫比较蛋白质组学(comparative proteomics)或表达蛋白质组学( expression proteomics)；③应用质谱分析或酵母双杂交法研究蛋白质与蛋质之间的相互作用，用以绘制某个体系的蛋白质作用的网络图谱，称为相互作用蛋白质组学。
蛋白质组的研究一般分为3个步骤：第一，蛋白质组分离技术。主要有双向凝胶电泳( two - di-mensional gel electrophoresis，2-DE)技术，因其高分辨率的优点现在被人们广泛使用，但也存在难以分离检测低丰度蛋白，极端酸碱性蛋白和疏水蛋白等缺点。非平衡pH梯度电泳(nonequilibrium pHgradient electrophoresis，NEPHGE)，主要用于碱性蛋白质的分离。Blue native - PAGE双向电泳(BN- PAGE)，主要用于膜性蛋白复合体等分子量大的蛋白质的分离。此外还有双向高效柱层析技术和液相柱色谱分离技术。第二，蛋白质的鉴定。80年代末以基质辅助激光解析电离( Matrix - assisted Laser Desorption Ionization，MALDI)和电喷雾电离(Electrospray Ionization，ESI)两项技术为基础，发展起来的基质辅助飞行时间质谱( matrix -assisted laser desportion ionization, MALDI- TOF-MS)，是当前最常用的分析技术。应用质谱技术可以得到蛋白质的肽质量指纹图谱(Peptide mass fingerprinting，PMF)，进而分析鉴定蛋白质。现在一些分离与鉴定技术相结合的方法在实践应用效果较好如2 -DE与免疫印迹技术相结合的方法一血清蛋白质组学分析方法(serum proteomics analy-SIS，SERPA)，在筛选与肿瘤相关的蛋白质应用较广。蛋白质芯片技术(protein chip&protein mi croarray)，现在应用较多的是蛋白质芯片与质谱技术相结合的表面增强激光解析离子化飞行时间质谱( surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)技术。生物分子相互作用的分析技术(biomo-lecular interaction analysis BIA)与MALDI -TOF- MS结合形成生物传感芯片质谱，可用于蛋白质的功能特性研究和蛋白质结构的分析。生物化学型蛋白质芯片，将已知的生物活性分子结合到芯片表面，来捕获样品中的靶蛋白。同位素标签相对绝对定量(iTRAQ)技术，能对肽段进行相对定量MS／MS，二级质谱也就是串联质谱鉴定。iTRAQ技术可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。
第三，应用生物信息学及蛋白质组信息学数据库对鉴定结果进行存储、处理、对比和分析。
注：引自R．J．辛普森．2003. Proteins andProteomics:ALaboratory Manual。
3 蛋白质组技术在牛疾病上的研究
3.1 蛋白质组技术在健康牛上的研究
首先需要对正常牛体不同组织和细胞的蛋白质组有个基础了解，才能进一步研究疾病对牛蛋白质组的影响（牛丽莉等，2009，杨永新等，2010）。不同体细胞数牛乳中乳蛋白比较蛋白质组学进行了研究（杨永新等，2011）。李珊珊(2011)[15对围产期奶牛血清蛋白质组学进行了初步研究；Lu et al．(2013)研究了干奶期奶牛的牛奶中与能量平衡相关的蛋白质组和代谢组的变化。刘荣等(2012)优化了奶牛乳腺上皮细胞核蛋白质组双向电泳方法，并在此基础上研究了中药王不留行对奶牛乳腺上皮细胞核蛋白质组学的影响（刘荣，2012）。
3.2 蛋白质组技术在牛乳房炎上的研究
乳房炎是影响奶业生产的主要疾病，蛋白质组学研究的研究也较多（张勇，2009，杨永新，2010），而且越来越具针对性，学者们对大肠杆菌性乳房炎（杨永新等，2010和金黄色葡萄球菌乳房炎( Reinhardt，2013)进行了蛋白质组分析。学者们在蛋白质组水平上研究亚临床和临床乳房炎的奶牛抵御不同病原体的反应，并筛选了潜在蛋白质的为生物标记物，为更好地理解乳房炎发病机理提供了研究方向( Romana，2012)。
3.3 蛋白质组技术在牛布氏杆菌上的研究
牛布氏杆菌( Br. Bovis)是一类革兰氏阴性短小杆菌，可引起母畜传染性流产。布鲁氏菌是一种细胞内的细菌病原体引起全球人畜共患病布鲁氏菌病。布鲁氏菌毒力依赖于它的能力过渡到宿主细胞内的细胞内的生活方式。因此，这种病原体必须检测其细胞内的定位，然后重新在宿主细胞内调整基因表达。在牛布氏杆菌的研究方面，利用免疫蛋白质组学技术筛选布鲁菌高免疫原性膜蛋白作为DNA疫苗的免疫抗原候选分子是预防此病的新途径(Roset，2013)。郭振华(2009)对牛种布鲁氏菌弱毒疫苗株s19与构建株△s19全菌蛋白的比较蛋白质组进行了研究；赵永坤等(2012)对感染牛布鲁菌544A的巨噬细胞蛋白质组学进行了分析。
3.4 蛋白质组技术在牛其他临床疾病上的研究
学者们分别对奶牛乳热症蛋白质组学(夏成，2010 c27])；蹄叶炎奶牛蛋白质组学(Sun，2013)；结核杆菌蛋白质组学（陆晔等，2011），学者们利用双向电泳与免疫印迹相结合筛选牛支原体免疫相关蛋白质组（陈维等，2012）；脲酶B亚单位疫苗免疫对奶牛血清蛋白质组分的影响(袁廷杰等，2012)等方面做了深入的研究和探索。Bouasria(2013)研究了黏膜表面的逆境胁迫诱导表达控制系统( SICE)在乳酸乳球菌的治疗性分子机制。奶牛酮病是一种常见的代谢性疾病。已知的诊断标记酮症，如丙酮和|3一羟基丁酸( BHBA)，但疾病预测仍然是一个难题。Matthias( 2012 )研究奶牛得酮症的致病的机理。通过对患有酮病奶牛的牛奶蛋白质组学的研究，发现在整个哺乳期，高甘油磷酸胆碱GPC与低酮病的发病率高度相关，并指出牛奶GPC与磷酸胆碱(PC)的比是一种可靠选择健康奶牛的指标。犊牛运输过程中，患肺炎和腹泻是造成死亡的主要原因，袁廷杰等( 2012 )对运输前后奶牛血清蛋白质组进行了研究。Senthilkumaran etal．(2013)收集了162头运输后犊牛的支气管肺泡灌洗液(BALF)，较低水平的膜联蛋白Al和A2是断奶和运输育肥牛肺炎的易感性增加的潜在生物标志物。手足口病是一种高度传染性的病毒性疾病，野生的和家养的偶蹄类动物。口蹄疫病毒与宿主细胞之间的复杂关系，导致它的复制和传播。BHK-21细胞系是一个口蹄疫病毒感染的体外模型，通常用于制备病毒种子。为了更好地理解这种关系的分子基础，2hang(2013)对感染口蹄疫病毒的幼仓鼠肾细胞蛋白质组学进行了研究，结果质谱确定了30个蛋白点改变（19个上调，下调2个病毒蛋白质斑点），其中包括蛋白质代谢过程，细胞骨架蛋白微丝相关蛋白，应激反应蛋白和口蹄疫病毒蛋白。Western blot分析进一步证实NME -2蛋白在蛋白质组的配置文件的差异表达。亚细胞定位证明NME2蛋白分布在BHK -21细胞的细胞质和细胞核上。
4 展望
生命科学是需要证明的实验性科学，生命科学的发展依赖于实验技术的发展。虽然MS-蛋白质组学开始走向成熟，并开始了通过仪器，样品制备和计算分析相结合的多元发展模式，但蛋白质组学仍需要技术的突破来推动蛋白质组学的发展。目前，还没有与核酸扩增的PCR技术相似的蛋白质扩增技术，对微量蛋白质的检测仍是问题。另一方面，单一学科很难诠释蛋白质间复杂的、动态的、连续的互为因果的关系。如何对这一庞大、抽象，又富于变化的问题加以分析，西方科学发展的经典过程是将复杂的事物加以分割并建立不同的模型，用不同学科各自的学科工具对某一特定变化的细节问题加以研究，再用比较方法加以分析。当这些研究积累到一定程度和深度时，再已某些理论为基础用系统的思想提出因果的假设，在不断的筛选、重复验证的过程中，提出假说对事物的变化进行解释。把一个学科的经典理论引入到另一个学科中加以研究，往往会得到一个崭新的领悟。例如19世纪Hermann von Helmholtz在他的能量代谢研究中引入了热力学第一定律，为我们对生物体内能量平衡的研究奠定了理论基础，改变了相应领域的研究思路。为此，不难看出新理论、合理假设的提出相比研究技术的创新要更能引领了相应学科的发展。随着学科的发展，学科分支越来越细。蛋白质组学为我们提供了完全崭新的思路直接运用系统生物学思想综合运用各学科理论，从整体上研究生命现象。个人的力量是有限的，需要多学科的学者共同的努力，建立以国家、各学科为单位的开放的、发散的，具有创新意识的研究团队或组织机构并开展技术交流。教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献：
[1] Alison Abbott. And now for the proteome [Jl. Nature, 2001,409(6822)：747．
[2] Http//www. hupo. org／( 2014,11. 15).
[3] Wasinger V C,Cordwell S J,Anne C D,et al.Progress with gene- product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitali-um[J]. Electrophoresis, 1995, 16(17):1090- 1094.
[4] Wilkins M R＆.Williams K I.,Appel R D,et al.Proteome re-search: new frontiers in functional genomics. 1997. Berlin: sp-inger Verlag.
[5] Kahn P.From genome to proteome: looking at a celh proteins[J]. Science,1995: 369-370.
[6] Humphery Smith I.,Cordwell S.J.and Blackstock W.P..Proteome Research: complementarity and limitations with re一spect to the RNA and DNA worlds[J]. Electrophoresis, 1997.18(8)：1217-1242.
[7] Fenn J B.Mann M.Meng C K.et al.Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecule.s [J]. Science. 1989(246):64-71.
[8] Karas M. Hillenkamp F.Laser desorption ionzation of proteins with molecular masses exceeding 10000 daltons [J]. Anal Chem,1988(60)：2299-2301.
[9] Simon Faulkner, Giuliano Elia, Michael P.Mullen, Padraic 0´Boyle, Michael J.Dunn and Dermot Morris.A compari-son ofthe bovine uterine and plasma proteome using iTRAQ pro-teomics[J]. Proteomics. 2012(12) :2014 - 2023.
[10] Timothy A. Reinhardt, Randy E.Sacco, Brian J.Nonnecke,John D.Lippolis. Bovine milk proteome: Quantitative changes in normal milk exosomes, milk fat globule membranes and whey proteomes resulting from Staphylococcus aureus mastitis[J]. Journal of Proteomics. 2013. Volume 82, 26: 141-154.
[11][澳lR．J．辛普森．2003. Proteins and Proteomics:ALabora-tory Manual-北京．科学出版社：567.
[12]牛丽莉，魏彩虹，李宏滨等，奶牛血浆蛋白质组学研究中双向凝胶电泳条件的优化[J]．中国农学通报，2009,25(20):30-34.
[13]杨永新，陶金忠，张勇等．奶牛乳腺组织蛋白质样品的制备及2- DE图谱分析[J]．畜牧兽医学报，2007,38(8)：846-850.
[14]杨永新，王加启，h登攀等．不同体细胞数牛乳中乳蛋白的比较蛋白质组学研究[J]．中国农业科学，2011, 44 (12)：2545 -2552.
[15]李珊珊．围产期奶牛血清蛋白质组学的初步研究[D]．中国农业科学院，2011.
[16] Lu J;Antunes Fernandes E; Paez Cano AE; Vinitwatanakhun J; Boeren S;van Hooijdonk T; van Knegsel A; Vervoort J;Hettinga KA.Changes in milk proteome and metabolome as-sociated with dry period length, energy balance, and lactation stage in postparturient dairy cows. [J].J Proteome Res. 2013(7): 87-93.
[17]刘荣，高学军，李庆章，等．奶牛乳腺上皮细胞核蛋白质组双向电泳方法的建立[J]．中国畜牧兽医，2012,39(2):31-34.
[18]刘荣，中药王不留行对奶牛乳腺上皮细胞核蛋白质组学的影响[D]．东北农业大学，2012.
[19]张勇，杨永新，赵兴绪，等，临床型奶牛乳房炎乳腺组织的比较蛋白质组研究[J]．中国农业科学，2009,42(4)：1442-1446.
[20]杨永新，张勇，周雷，等．奶牛乳房炎乳腺膜蛋白的比较蛋白质组学研究[J]．中国农业科学，2010,43(18):3862-3868.
[21]杨永新，程广龙，赵辉玲，等．大肠杆菌性乳房炎奶牛血浆的比较蛋白质组研究[J]．畜牧兽医学报，2010,41(9):1191-1197.
[22] Reinhardt T.A.,Randy E.Sacco, Brian J.Nonnecke, JohnD. LippoLis. Bovine milk proteome: Quantitative changes.nnormal milk exosomes, milk fat globule membranes and whey proteomes resulting from StaphyLococcus aureus mastitis.Journal of Proteomics[J]. 2013. Volume 82, 26.:141-154.
[23] Romana Turk, Cristian Piras, Mislav Kova i,Marko Samard ija, Hany Ahmed, Michele De Canio, Andrea Urbani, Zlata FLegar Metri, Alessio Soggiu, I.uigi Bonizzi, Paola Roncada. Proteomics of inflammatory and oxidative stress response in cows with subclinical and clinical mastitis[J]. Journal of Pro-teomics. 2012(14):4412-4428.
[24] Mara S.Roset, Lucia Garcia Fernandez, Vito G. DeIVecchio and Gabriel Briones[J]. Infect. Immun. 2013, 81(2):521.
[25]郭振华．牛种布鲁氏菌弱毒疫苗株s19与构建株As19全菌蛋白的比较蛋白质组研究[D].内蒙古民族大学，2009.
[26]赵永坤，杨艳玲，孙春晖，等．感染牛布鲁菌544A的巨噬细胞蛋白质组学分析[J].动物医学进展，2012,33(5)：47-51.
[27]夏成，杨龙蛟，张洪友，等．比较蛋白质组学技术及其在奶牛乳热研究方面的展望[J]．现代畜牧兽医，2010,(3):65-68.
[28] Sun D, Zhang H, Guo D, Sun A, Wang H(2013) Shotgun Proteomic Analysis of Plasma from Dairy Cattle Suffering from Footrot: Characterization of Potential Disease - Associated Factors[J]. PLoS ONE 8(2): e55973.
[29]陆晔，梅建，胡衡，等．人结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌差异蛋白质组学的研究[J].中华结核和呼吸杂志，2011,34(3)：197- 200.
[30]陈维，李媛，辛九庆，等，牛支原体蛋白质组学双向电泳技术的建立及初步分析[J]．东北农业大学学报，2012,43(3):42-47.
[31]袁廷杰，王加启，杨永新，等．脲酶B亚单位疫苗免疫对奶牛血清蛋白质组分的影响[J]．华北农学报，2012,27(5):198-202.
[32] Bouasria Benbouziane, Pedro Ribelle.s, Camille Aubry, Rebeca Martin, Pascale Kharrat, Ali Riazi, Philippe Langella, Luis G. Bermudez- Humaran. Development of a Stress-Inducible Controlied Expression (SICE) system in I.actococcus lactis for the production and delivery of therapeutic molecules at mucosal surfaces[J]. Journal of Biotechnology. 2013. Volume 168, Is- sue 2．20:120-129.
[33] Matthias S.Klein; Nina Buttchereit;Sebastian P.Miemczyk;Ann- Kathrin Immervoll; Caridad I.ouis; Steffi Wiedemann;Wolfgang Junge;Georg Thaller; Peter J.Oefner and Wolfram Gronwald. NMR Metabolomic Analysis of Dairy Cows Reveals Milk Glycerophosphocholine to Phosphocholine Ratio as Prog-nostic Biomarker for Risk of Ketosis[Jl. Journal of Proteome Research.2012(2):1373-1381.
[34]袁廷杰 ,王加启 ,杨永新 ,等.运输前后奶牛血白质组的变化 [J].中国农业科学,2012,45 ( 9) :1807- 1813.
[35] Chandrika Senthilkumaran, Mary Ellen Clark, Khaled Ab-delaziz, Ken G Bateman, Allison MacKay,Joanne Hewson5 and Jeff L Caswell, Increa.sed annexin Al and A2 levels in bronchoalveolar lavage fluid are associated with resi-stance to respiratory disease in beef calves[J]. Veterinary Re.search.2013, 44:24.
[36] Zhang Keshan, Guodong Lu, Yongjie Liu, Hanjin Kong. You- jun Shang and Xiangtao IJiu . Alteration of BHK - 21 cells pro-teome after foot- and- mouth disease virus infection[J]. Afri-can Journal of Microbiology Research. 2013. Vol. 7(40) :4828- 4834.
[37] A. F. Maarten Altelaar, Javier Munoz &- Albert J. R. Heck. Next- generation proteomics: towards an integrative view ofproteome dynamics. V rature Reviews Genetics. 2013 ( 14 ) : 35 -48 .
